單克隆抗體技術講解PPT課件

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抗體工程制藥 單克隆抗體的制備,1,掌握：單克隆抗體的概念和特點、制備原理，制備方法及基本過程熟悉：單克隆抗體技術的應用了解：單克隆抗體的發(fā)展,2,主要內容,3,銀屑病,手口足病,癌癥,亞急性濕疹,沒有單克隆抗體前人類所遇見的問題,4,用于診斷鑒定人的血型類別,用于尋常型銀屑病亞急性濕疹,用于復發(fā)或耐藥的濾泡性中央型淋巴瘤,犬瘟熱病毒單克隆抗體,單克隆抗體藥物,5,Georges J.F. Kohler,Cesar Milstein,1975年將產生抗體的淋巴細胞與腫瘤細胞融合, 成功建立了單克隆抗體技術。,1984年獲得諾貝爾醫(yī)學和生理學獎。,一、單克隆抗體技術發(fā)展,6,1.概念（1）抗體：是機體在抗原刺激下產生的能與該抗原特異性結合的免疫球蛋白。,（2）單克隆抗體（monoclonal antibody ）：(簡稱單抗 )，由經過特定的抗原處理過的效應B細胞和骨髓瘤細胞雜交得到的雜交瘤細胞產生的具有特異性識別某抗原上的某一個特定抗原決定簇的抗體。,二、單克隆抗體的概念及特點,7,2. 單克隆抗體的特點優(yōu)點 ：（1）理化性狀高度均一、結構、氨基酸順序、特異性等 一致 （2）生物活性單一、靈敏度高 （3）與抗原結合的特異性強，適用于以標記抗體為特點的免疫學分析方法 （4）便于人為處理和質量控制，來源容易，可以在體外“永久”地存活并傳代 （5）可用于體內的放射免疫顯像和免疫導向治療,8,局限性 ：（1）固有的親和性和局限的生物活性限制了它的應用范圍 （2）反應強度不如多克隆抗體 （3）制備技術復雜、費時費工、價格較高,9,三、單克隆抗體技術的應用,1.檢驗醫(yī)學診斷 （1）病原微生物抗原抗體的檢測：乙肝表面抗原試紙 （2）腫瘤抗原的檢測 （3）免疫細胞及其亞群的檢測 （4）激素測定：早孕檢測試紙、女性排卵檢測試紙 （5）細胞因子的測定 （6）其他：嗎啡類毒品檢測試紙等 2.蛋白質的提純 3.腫瘤的導向治療和放射免疫顯像技術,10,克隆化過程,四、單克隆抗體制備過程,11,1.致敏淋巴細胞的準備 動物選擇：品系、年齡、性別、健康狀態(tài) 抗原接種：方式體內、體外劑量0.5-100g次數視抗原而定間隔視抗原而定佐劑視抗原而定 收集時間：末次接種后72 h2.骨髓瘤細胞的準備 細胞株處于良好的生長狀態(tài) 細胞株保持HGPRT缺陷狀態(tài)HGPRT：次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶,12,離心 1000rpm 10 min,50%PEG 1 mL,培養(yǎng)液 10 mL,離心 1000rpm 7min,37 C搖動、由慢漸快1min、靜止1.5min,加入HAT培養(yǎng)液懸浮細胞，置于培養(yǎng)孔內,3. 細胞融合,13,4. HAT選擇性培養(yǎng)HAT是用于篩選具有次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶(HPRT)或胸苷激酶 (TK)活性缺陷細胞的培養(yǎng)基。含有次黃嘌呤(H)、氨基蝶呤(A)、胸苷(T)和甘氨酸。在氨基蝶呤(二氫葉酸類似物)存在下，這種酶缺陷的細胞不能通過核苷酸合成旁路合成次黃嘌呤和胸苷。HPRT和TK缺陷細胞可以在此培養(yǎng)基中生存。是常用的骨髓雜交瘤細胞選擇性培養(yǎng)基。,14,5. 抗體分泌細胞的篩選對篩選方法的要求：多大量樣品一次檢測；快迅速取得檢測結果；準檢測結果可靠性高； 靈檢測方法靈敏度高。常用篩選方法：ELISA、IFA等,15,6. 克隆化過程方法：有限稀釋法 克隆建立的標準：連續(xù)兩次以上100%陽性孔 飼養(yǎng)細胞：同品系小鼠腹腔、胸腺、脾細胞,16,B淋巴細胞,注射特定抗原蛋白,骨髓瘤細胞,培養(yǎng)骨髓瘤細胞,融合,多種雜交細胞,專一抗體檢驗陽性,克隆上述雜交細胞,分開不同雜交細胞，克隆專一抗體，檢驗陽性細胞,單克隆抗體,注射到小鼠體內,體外培養(yǎng),7. 單克隆抗體的制取,體內腹腔接種,體外培養(yǎng)罐法,17,思考：,1、如何大量生產單克隆抗體？,2、為什么選用小鼠骨髓瘤細胞與B細胞融合？,18,謝謝祝：同學們學習進步,19,