血紅蛋白的提取和分離ppt課件
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課題背景 新華網首爾03年 月 日電韓國浦項工業(yè)大學科學家 日宣布 他們已查明可抑制艾滋病病毒感染的 蛋白質核心部分的結構 浦項工業(yè)大學生物科學系教授吳秉夏等人 當天公開了 蛋白質內核心部分 的三維分子結構 并稱已弄清楚這一結構的正確位置及它與其他結構之間的相互作用 研究成果發(fā)表在最新一期 分子細胞 雜志上 2 年英國 自然 雜志曾刊登論文說 蛋白質可有效抑制艾滋病病毒的感染 此后 世界各地的很多科學家開始研究 蛋白質的結構 但到目前為止尚未有人宣稱取得突破性進展 對蛋白質的研究有助于人們對生命過程的認識和理解 通常科學研究需要獲得純度較高的蛋白質 怎樣才能從復雜的混合物中提取和純化蛋白質呢 1 2 本課題學習目標 1 主要概念 凝膠色譜法 電泳法 緩沖溶液 它們在血紅蛋白的提取中分別起到什么作用 主要原理 凝膠色譜法分離蛋白質的原理 電泳法分離樣品的原理 緩沖溶液的組成和作用機理 3 一 蛋白質分離和提取的原理 一 基礎知識 根據蛋白質各種特性的差異 分子的形狀 大小電荷性質和多少溶解度吸附性質對其他分子親和力 4 一 凝膠色譜法 分配色譜法 2 凝膠 大多數凝膠是由多糖類化合物 如葡聚糖或瓊脂糖 構成的多孔小球體 內部有許多貫穿的通道 根據被分離物質的蛋白質相對分子質量的大小 利用具有網狀結構的凝膠 來進行分離 1 概念 3 凝膠色譜法的原理 當相對分子量不同的蛋白質通過凝膠時 相對分子量較小的蛋白質容易進入凝膠內部的通道 路程較長 移動速度較慢 相對分子量較大的蛋白質無法進入凝膠內部的通道 只能在凝膠外部移動 路程較短 移動速度較快 相對分子質量不同的蛋白質分子因此得以分離 依據的特性是 蛋白質分子量的大小 5 二 緩沖溶液 1 概念 在一定的范圍內 凡是能夠抵制外加少量強酸或強堿的影響使原來溶液PH值基本保持不變的混合溶液 能夠抵制外界的酸和堿對溶液PH值的影響 維持PH基本不變 2 作用 3 緩沖溶液的配制 通常由1 2種緩沖劑溶解于水中配制而成 調節(jié)緩沖劑的使用比例就可以制得在不同PH范圍內使用的緩沖液 4 提問 在本課題中使用的緩沖液是 其目的是 利用緩沖液模擬細胞內的PH環(huán)境 保證血紅蛋白的正常結構和功能 便于觀察 紅色 和科學研究 活性 磷酸緩沖液 6 三 電泳 1 概念 帶電粒子在電場作用下發(fā)生遷移的過程 2 原理 許多重要的生物大分子 如多肽 核酸等都具有可解離的基團 在一定的PH下 這些基團會帶上正電或負電 在電場的作用下 這些帶電分子會向著與其所帶電荷相反的電極移動 電泳利用了待分離樣品中各種分子帶電性質的差異以及分子本身的大小 形狀的不同 使帶電分子產生不同的遷移速度 從而實現樣品中各種分子的分離 3 類型 瓊脂糖凝膠電泳 聚丙稀酰胺凝膠電泳 7 知識點一 凝膠色譜法分離蛋白質的原理和具體過程 8 9 凝膠色譜法的原理 依據的特性是 蛋白質分子量的大小 10 在電場的作用下 這些帶電分子會向著與其所帶電荷相反的電極移動 知識點二 電泳 11 瓊脂糖凝膠電泳是用瓊脂糖作支持介質的一種電泳方法 其分析原理與其他支持物電泳的最主要區(qū)別是 它兼有 分子篩 和 電泳 的雙重作用 瓊脂糖凝膠具有網絡結構 物質分子通過時會受到阻力 大分子物質在涌動時受到的阻力大 因此在凝膠電泳中 帶電顆粒的分離不僅取決于凈電荷的性質和數量 而且還取決于分子大小 這就大大提高了分辨能力 但由于其孔徑相當大 對大多數蛋白質來說其分子篩效應微不足道 現廣泛應用于核酸的研究中 蛋白質和核酸會根據pH不同帶有不同電荷 在電場中受力大小不同 因此跑的速度不同 根據這個原理可將其分開 1 瓊脂糖凝膠電泳 12 原理 聚丙烯酰胺凝膠為網狀結構 具有分子篩效應 它有兩種形式 非變性聚丙烯酰胺凝膠及SDS 聚丙烯酰胺凝膠 SDS PAGE 非變性聚丙烯酰胺凝膠 在電泳的過程中 蛋白質能夠保持完整狀態(tài) 并依據蛋白質的分子量大小 蛋白質的形狀及其所附帶的電荷量而逐漸呈梯度分開 SDS PAGE 僅根據蛋白質亞基分子量的不同就可以分開蛋質白 在樣品介質和丙烯酰胺凝膠中加入離子去污劑和強還原劑后 蛋白質亞基的電泳遷移率主要取決于亞基分子量的大小 可以忽略電荷因素 2 聚丙烯酰胺凝膠電泳 作用原理 教材P66 13 人們用雞的紅細胞提取DNA 用哺乳動物的紅細胞提取血紅蛋白的原因是什么 雞的紅細胞具有細胞核 含有DNA 便于進行DNA的提取 哺乳動物成熟的紅細胞無細胞核 結構簡單 血紅蛋白含量豐富便于提取血紅蛋白 思考 二 血紅蛋白的提取和分離 14 血液組成 注 抗凝劑常用檸檬酸鈉 15 實驗操作 一 樣品處理 血液的組成成分 16 血紅蛋白由四個肽鏈組成 如圖 包括兩個 肽鏈和兩個 肽鏈 其中每條肽鏈環(huán)繞一個亞鐵血紅素基團 此基團可攜帶一分子氧或一分了二氧化碳 血紅蛋白因含有血紅素而呈現紅色 實驗操作 一 樣品處理 17 二 實驗操作 新鮮血液 樣品處理 粗分離 純化 純度鑒定 18 1 紅細胞的洗滌 閱讀課本內容 回答以下問題 1 洗滌的目的 2 怎樣洗滌 3 洗滌干凈的標志是什么 直至上清液中沒有黃色 表明紅細胞已洗滌干凈 實驗操作 一 樣品處理 除去其中的雜蛋白 以利于后續(xù)血紅蛋白的分離純化 血液 檸檬酸鈉 低速短時離心 吸出上層血漿 紅細胞 5倍體積生理鹽水 緩慢攪拌10min 低速短時離心 吸出上清液 反復洗滌直至上清液無黃色 速度越高和時間越長會使白細胞和淋巴細胞等一同沉淀達不到分離的效果 能否用蒸餾水或者高濃度的氯化鈉 19 磁力攪拌器 20 2 血紅蛋白的釋放 將洗滌好的紅細胞倒入燒杯中 加蒸餾水到原血液的體積 再加40 體積的甲苯 置于磁力攪拌器上充分攪拌10min 在蒸餾水和甲苯的作用下 紅細胞破裂 釋放出血紅蛋白 思考 蒸餾水和甲苯的作用 實驗操作 一 樣品處理 蒸餾水 紅細胞過度吸水破裂甲苯 溶解細胞膜 有利于提取和分離血紅蛋白 21 3 分離血紅蛋白溶液 1 采用什么方法分離血紅蛋白 2 離心分層后 各層的成分各是什么 3 用濾紙過濾 去掉什么成分 實驗操作 一 樣品處理 紅細胞破碎混合液 中速長時離心 2000c min 10min 濾紙過濾除去脂質 分液漏斗分離出血紅蛋白 得到紅色透明液體 除去脂質類和紅細胞破碎物沉淀層 22 取1mL的血紅蛋白溶液裝入透析袋中 將透析袋放入盛有300mL的物質的量濃度為20mmol L的磷酸緩沖液中 pH為7 0 透析12h 4 透析 透析過程 透析目的 除去樣品中分子量較小的雜質 透析的原理透析袋是一種半透膜 能使小分子自由進出 而大分子不能通過 思考 根據材料進行實驗設計 現有燒杯一只 透析袋一個 碘液 淀粉溶液 鐵架臺一個 棉線若干 探究碘液 淀粉是否能通過透析袋 寫出實驗步驟和結果預測 實驗操作 一 樣品處理 23 利用透析袋透析 24 透析過程動畫演示 25 二 凝膠色譜操作 1 凝膠色譜柱的制作 取長40厘米 內徑1 6厘米的玻璃管 兩端需用砂紙磨平 底塞的制作 打孔 挖出凹穴 安裝移液管頭部 覆蓋尼龍網 再用100目尼龍紗包好 插到玻璃管的一端 注意事項 底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面 否則難以鋪實尼龍網 還會導致液體殘留 蛋白質分離不徹底 頂塞的制作 打孔 安裝玻璃管 組裝 將上述三者按相應位置組裝成一個整體 安裝其他附屬結構 26 2 凝膠色譜柱的裝填 凝膠的選擇 A 材料 交聯葡聚糖凝膠 G 75 B 代表意義 G 表示凝膠的交聯程度 膨脹程度及分離范圍 75表示凝膠的得水值 即每克凝膠膨脹時吸水7 5克 凝膠的前處理 配置凝膠懸浮液 計算并稱取一定量的凝膠浸泡于蒸餾水中充分溶脹后 配成凝膠懸浮液 凝膠色譜柱的裝填方法 A 固定 將色譜柱裝置固定在支架上 B 裝填 將凝膠懸浮液一次性的裝填入色譜柱內 裝填時輕輕敲動色譜柱 使凝膠填裝均勻 注意裝填凝膠柱時不得有氣泡存在 因為氣泡會攪亂洗脫液中蛋白質的洗脫次序 降低分離效果 27 洗滌平衡 裝填完畢后 立即用緩沖液洗脫瓶 在50cm高的操作壓下 用300ml的20mmol l的磷酸緩沖液 pH為7 0 充分洗滌平衡12小時 使凝膠裝填緊密 注意 1 液面不要低于凝膠表面 否則可能有氣泡混入 影響液體在柱內的流動與最終生物大分子物質的分離效果 2 不能發(fā)生洗脫液流干 露出凝膠顆粒的現象 28 3 樣品加入與洗脫 調節(jié)緩沖液面 打開下端出口 使柱內緩沖液緩慢下降到與凝膠面平齊 關閉出口 滴加透析樣品 吸管吸1ml樣品加到色譜柱的頂端 滴加樣品時 吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動加樣 同時注意不要破壞凝膠面 樣品滲入凝膠床 加樣后打開下端出口 使樣品滲入凝膠床內 等樣品完全進入凝膠層后 關閉下端出口 洗脫 小心加入pH 7 0的20mmol l的磷酸緩沖液到適當高度 連接緩沖液洗脫瓶 打開下端出口進行洗脫 收集 待紅色的蛋白質接近色譜柱底端時 用試管收集流出液 每5ml收集一試管 連續(xù)收集 在分離過程中 如果紅色區(qū)帶均勻一致的移動 說明色譜柱制作成功 注意 正確的加樣操作 1 不要觸及并破壞凝膠面 2 使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動 29 三 純度鑒定 SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳 判斷純化的蛋白質是否達到要求 需要進行蛋白質的鑒定 30 蛋白質的提取和分離一般分為四步 1 樣品處理 包括洗滌紅細胞 血紅蛋白的釋放 離心等操作收集血紅蛋白溶液 2 粗分離 透析除去分子較小的雜質 3 純化 通過凝膠色譜法將分子量較大的雜質蛋白質除去 4 純度鑒定 通過SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定 小結 31 1 用凝膠色譜法分離蛋白質時 分子量大的蛋白質A 路程較長 移動速度較慢B 路程較長 移動速度較快C 路程較短 移動速度較慢D 路程較短 移動速度較快 D 2 使用SDS 聚丙烯酰胺電泳過程中 不同蛋白質的電泳遷移率完全取決于A電荷的多少B分子的大小C肽鏈的多少D分子形狀的差異 B 3 下列是有關血紅蛋白提取和分離的相關操作 其中正確的是A 可采集豬血作為實驗材料B 用蒸餾水重復洗滌紅細胞C 血紅蛋白釋放后應低速短時間離心D 洗脫液接近色譜柱底端時開始收集流出液 A 32
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