瓊脂糖凝膠電泳準備手冊.doc

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瓊脂糖凝膠電泳準備手冊 準備干凈的配膠板和電泳槽 注意DNA酶污染的儀器可能會降解DNA，造成條帶信號弱、模糊甚至缺失的現象。 選擇電泳方法 一般的核酸檢測只需要瓊脂糖凝膠電泳就可以；如果需要分辨率高的電泳，特別是只有幾個bp的差別應該選擇聚丙烯酰胺凝膠電泳；用普通電泳不合適的巨大DNA鏈應該使用脈沖凝膠電泳。注意巨大DNA鏈用普通電泳可能跑不出膠孔導致缺帶。 正確選擇凝膠濃度 對于瓊脂糖凝膠電泳，濃度通常在0.5～2％之間，低濃度的用來進行大片段核酸的電泳，高濃度的用來進行小片段分析。低濃度膠易碎，小心操作和使用質量好的瓊脂糖是解決辦法。注意高濃度的膠可能使分子大小相DNA帶不易分辨，造成條帶缺失現象。 適合的電泳緩沖液 常用的緩沖液有TAE和TBE，而TBE比TAE有著更好的緩沖能力。電泳時使用新制的緩沖液可以明顯提高電泳效果。注意電泳緩沖液多次使用后，離子強度降低，PH值上升，緩沖性能下降，可能使DNA電泳產生條帶模糊和不規(guī)則的DNA帶遷移的現象。 電泳的合適電壓和溫度 電泳時電壓不應該超過20V/cm，電泳溫度應該低于30℃，對于巨大的DNA電泳，溫度應該低于15℃。注意如果電泳時電壓和溫度過高，可能導致出現條帶模糊和不規(guī)則的DNA帶遷移的現象。特別是電壓太大可能導致小片段跑出膠而出現缺帶現象。 DNA樣品的純度和狀態(tài) 注意樣品中含鹽量太高和含雜質蛋白均可以產生條帶模糊和條帶缺失的現象。乙醇沉淀可以去除多余的鹽，用酚可以去除蛋白。注意變性的NA樣品可能導致條帶模糊和缺失，也可能出現不規(guī)則的DNA條帶遷移。在上樣前不要對DNA樣品加熱，用20mM NaCl緩沖液稀釋可以防止DNA變性。 DNA的上樣 正確的DNA上樣量是條帶清晰的保證。注意太多的DNA上樣量可能導致DNA帶型模糊，而太小的DNA上樣量則導致帶信號弱甚至缺失。TIANGEN公司DNA分子量標準每次上樣6ul即可得到清晰均勻的條帶。 Marker的選擇 DNA電泳一定要使用DNA Marker或已知大小的正對照DNA來估計DNA片段大小。Marker應該選擇在目標片段大小附近ladder較密的，這樣對目標片段大小的估計才比較準確。TIANGEN公司的DNA Marker條帶清晰，亮度均勻，質量穩(wěn)定，是您實驗的首選。需要注意的是Marker的電泳同樣也要符合DNA電泳的操作標準。如果選擇λDNA/HindIII或者λDNA/EcoRI的酶切Marker，需要預先65℃加熱5min，冰上冷卻后使用。從而避免HindIII或EcoRI酶切造成的粘性接頭導致的片段連接不規(guī)則或條帶信號弱等現象。 凝膠的染色和觀察 實驗室常用的核酸染色劑是溴化乙啶（EB），染色效果好，操作方便，但是穩(wěn)定性差，具有毒性。而其他系列例如SYBR Green，GelRed，雖然毒性小，但價格昂貴。TIANGEN公司的GeneGreen相比則是性價比高的低毒替代染料，其靈敏度比傳統(tǒng)EB染料高10倍以上。注意觀察凝膠時應根據染料不同使用合適的光源和激發(fā)波長，如果激發(fā)波長不對，條帶則不易觀察，出現條帶模糊的現象。