《rna生物合成》PPT課件.ppt

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1、RNA Biosynthesis (Transcription) The biochemistry and molecular biology department of CMU RNA 生物合成 (轉(zhuǎn)錄 ) 第十一章 轉(zhuǎn)錄（ transcription） 生物體以 DNA為模板合成 RNA的過(guò)程 。 轉(zhuǎn)錄 RNA DNA 轉(zhuǎn)錄與復(fù)制的相似點(diǎn)： 1. 模板均為 DNA； 2. 延長(zhǎng)機(jī)理都是形成磷酸二酯鍵； 3. 方向均為 5 3。 轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的區(qū)別 復(fù)制 轉(zhuǎn)錄 模板 DNA雙 鏈 DNA的 一條 鏈 原料 dNTP (N=A、 G、 C、 T) NTP(N=A、 G、 C、 U) 引物 需要

2、不 需要 酶 DNA聚合酶 RNA聚合酶 產(chǎn)物 DNA RNA 配對(duì) A-T、 G-C A-U、 T-A、 G-C 參與轉(zhuǎn)錄的物質(zhì) 原料 : NTP（ ATP, UTP, GTP, CTP） 模板 : DNA 酶 : RNA聚合酶（ RNA polymerase, RNA-pol） 其他蛋白質(zhì)因子 第一節(jié) 轉(zhuǎn)錄的模板和酶 Templates of Transcription and Enzymes 一、轉(zhuǎn)錄模板 5 3 3 5 結(jié) 構(gòu) 基 因 （ s t r u c t u r a l g e n e ） 雙鏈 DNA分子中能作為模板轉(zhuǎn)錄出 RNA的那條鏈，稱(chēng)為 模板鏈 。又叫有意 義鏈（ s

3、ense strand）或 Watson鏈。 另一條互補(bǔ)鏈稱(chēng)為 編碼鏈 ，又叫反 義鏈（ antisense strand）或 Crick鏈。 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 RNA的堿基序列，除了 T 變 U 外，其余與編碼鏈相同。 G C A G T A C A T G T C5 3 3 C G T C A T G T A C A G 5 D N A 模 板 鏈 編 碼 鏈 轉(zhuǎn) 錄 R N A G C A G U A C A U G U C5 3 不對(duì)稱(chēng)轉(zhuǎn)錄 (asymmetric transcription) 在 DNA分子雙鏈上某一區(qū)段，一股鏈 可轉(zhuǎn)錄，另一股鏈不轉(zhuǎn)錄； 模板鏈并非永遠(yuǎn)在同一單鏈上。 二、

4、RNA聚合酶（ DDRP） 1. 原核生物的 RNA聚合酶 E.coli的 RNA聚合酶是由四種亞基 組成的六聚體（ 2 ） 核 心 酶 （ c o r e e n z y m e ）全 酶 （ h o l o e n z y m e ） RNA聚合酶全酶及核心酶電泳圖譜 E. coli RNA聚合酶組分 亞基 分子量 功 能 36512 決定哪些基因被轉(zhuǎn)錄 150618 催化功能 155613 結(jié)合 DNA模板 70263 辨認(rèn)起始點(diǎn) 其他原核生物的 RNA聚合酶，在結(jié)構(gòu)、 組成、功能上均與 E.coli相似。 原核生物的 RNA聚合酶都受一類(lèi)抗 結(jié)核藥 利福平 或 利福霉素 的特異性抑制。

5、 這類(lèi)藥物能與 RNA聚合酶的 亞基特異結(jié) 合，從而影響酶的活性。 RNA聚合酶全酶在轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的結(jié)合 2. 真核生物的 RNA聚合酶 種類(lèi) I II III 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 45S-rRNA hnRNA 5S-rRNA tRNA, snRNA 對(duì)鵝膏蕈 堿的反應(yīng) 不敏感 極敏感 中度敏感 RNA聚合酶 、 、 都由多個(gè) 亞基組成。有些亞基是三種酶所共有。 mRNA是各種 RNA中壽命最短、 最不穩(wěn)定的，需經(jīng)常重新合成。因此 RNA聚合酶 是三種酶中最活躍的。 三、酶與模板的辨認(rèn)結(jié)合 原核生物一個(gè)轉(zhuǎn)錄區(qū)段可視為一個(gè)轉(zhuǎn) 錄單位，稱(chēng)為 操縱子 (operon)，包括若干個(gè) 結(jié)構(gòu)基因 及其上游 (upst

6、ream)的 調(diào)控序列 。 RNA聚合酶結(jié)合模板 DNA的部位稱(chēng)為 啟動(dòng)子 (promoter)。是調(diào)控轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵部位。 5 3 3 5 調(diào) 控 序 列 結(jié) 構(gòu) 基 因 啟 動(dòng) 子R N A - p o l RNA聚合酶 保護(hù)法 開(kāi)始轉(zhuǎn)錄 T T G A C A A A C T G T -35 區(qū) T A T A A T Pu A T A T T A Py -10 區(qū) 1 -30 -50 10 -10 -40 -20 5 3 3 5 原核生物啟動(dòng)子保守序列 5 5 RNA聚合酶保護(hù)區(qū) 結(jié)構(gòu)基因 3 3 N 1 7 T T A A C T N 7 A N 1 6 T A T G A T N 7

7、A N 1 7 T A T G T T N 6 A N 1 6 T A T A A T N 7 A N 1 8 T A C T G T N 6 A T T T A C A T T T A C A T T G A C A T T G A T A C T G A C G t r p t R N A T r p l a c r e c A a r a 區(qū) 區(qū)3 5 1 0 + 1 最 大 一 致 性 T T G A C A T A T A A T x / 4 5 3 8 3 6 2 9 3 7 3 7 2 8 4 0 2 5 3 0 4 1 2 9 4 4 原核生物啟動(dòng)子 35區(qū)： 一致性序列為 T

8、TGACA 是 RNA-pol的 辨認(rèn)位點(diǎn) 10區(qū)： 一致性序列為 TATAAT 又叫 Pribnow盒 是 RNA-pol的 結(jié)合位點(diǎn) 真核生物啟動(dòng)子 結(jié) 構(gòu) 基 因 G C G C C A A T T A T A 內(nèi) 含 子外 顯 子 外 顯 子 轉(zhuǎn) 錄 起 始 C A A T 盒 G C 盒 增 強(qiáng) 子 順 式 作 用 元 件 T A T A 盒 ( H o g n e s s b o x ) 第二節(jié) 轉(zhuǎn)錄過(guò)程 The Process of Transcription 分為三個(gè)階段： 起始 (initiation) 延長(zhǎng) (elongation) 終止 (termination) 一、原

9、核生物的轉(zhuǎn)錄過(guò)程 （一）轉(zhuǎn)錄起始 1. RNA聚合酶結(jié)合在轉(zhuǎn)錄模板的起始區(qū) 域。 2. DNA雙鏈解開(kāi)，以一條鏈為模板，合 成第一個(gè)磷酸二酯鍵。 2. DNA雙鏈解開(kāi)。 1. RNA聚合酶全酶 (2)與模板結(jié)合。 3. 在 RNA聚合酶作用下發(fā)生第一次聚合反 應(yīng)，形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物。 5-pppG -OH + NTP 5-pppGpN - OH 3 + PPi 轉(zhuǎn)錄起始過(guò)程 RNApol (2) - DNA - pppGpN- OH 3 轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物 （二）轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng) 1. 亞基脫落， RNApol聚合酶核心酶變 構(gòu)，與模板結(jié)合松弛，沿著 DNA模板前 移； 2. 在 核心酶 作用下， NTP

10、不斷聚合， RNA鏈不斷延長(zhǎng)。 (NMP) n + NTP (NMP) n+1 + PPi 轉(zhuǎn)錄泡 （ transcription bubble） ： 在轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)過(guò)程中，由局部打開(kāi)的 DNA雙鏈 、 RNA聚合酶核心酶 及新生成 的 RNA三者結(jié)合在一起的復(fù)合體，為空 泡狀結(jié)構(gòu)，又稱(chēng)轉(zhuǎn)錄復(fù)合物。 電鏡下原核生物轉(zhuǎn)錄過(guò)程中的羽毛狀現(xiàn)象 轉(zhuǎn)錄未完成，翻譯已開(kāi)始進(jìn)行。 轉(zhuǎn)錄的起始及延長(zhǎng)過(guò)程 (三 ) 轉(zhuǎn)錄終止 RNA聚合酶在 DNA模板上停頓下 來(lái)，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 RNA鏈從轉(zhuǎn)錄復(fù)合物上脫 落下來(lái)。 分類(lèi)： 依賴(lài) Rho ()因子的轉(zhuǎn)錄終止 非依賴(lài) Rho因子的轉(zhuǎn)錄終止 1. 依賴(lài) 因子的轉(zhuǎn)錄終止 因子是

11、同六聚體蛋白； 因子能結(jié)合 RNA，與 poly C的結(jié)合力最 強(qiáng)； 因子還有 ATP酶和解螺旋酶的活性。 2. 不依賴(lài) 因子的轉(zhuǎn)錄終止 DNA模板上靠近終止處，有特殊的堿 基序列，轉(zhuǎn)錄出 RNA后， RNA產(chǎn)物形成特 殊的結(jié)構(gòu)來(lái)終止轉(zhuǎn)錄。 莖環(huán)結(jié)構(gòu)終止轉(zhuǎn)錄的機(jī)理 使 RNA聚合酶變構(gòu)，轉(zhuǎn)錄停頓； 使轉(zhuǎn)錄復(fù)合物趨于解離， RNA產(chǎn)物釋 放。 二、真核生物的轉(zhuǎn)錄過(guò)程 （一）轉(zhuǎn)錄起始 真核生物的轉(zhuǎn)錄起始上游區(qū)段比原核 生物多樣化 ， 轉(zhuǎn)錄起始時(shí) ， RNA-pol不 直接結(jié)合模板 ， 其起始過(guò)程比原核生物 復(fù)雜 。 轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn) TATA盒 CAAT盒 GC盒 增強(qiáng)子 順式作用元件 (cis-act

12、ing element) 1. 轉(zhuǎn)錄起始前的上游區(qū)段 AATAAA 切離加尾 轉(zhuǎn)錄終止點(diǎn) 修飾點(diǎn) 外顯子 翻譯起始點(diǎn) 內(nèi) 含 子 OCT-1 OCT-1： ATTTGCAT八聚體 2. 轉(zhuǎn)錄因子 能直接或間接辨認(rèn)和結(jié)合轉(zhuǎn)錄上游區(qū) 段 DNA的蛋白質(zhì)，統(tǒng)稱(chēng)為 反式作用因子 (trans-acting factors)。 反式作用因子中，直接或間接結(jié)合 RNA聚合酶的，則稱(chēng)為 轉(zhuǎn)錄因子 (trans- criptional factors, TF)。 參與 RNA-pol 轉(zhuǎn)錄的 TF 轉(zhuǎn)錄因子 亞基和 (或 )分子量（ kDa） 功能 TF D TBP， 38 結(jié)合 TATA盒 TAF 輔助 T

13、BP-DNA結(jié)合 TF A 12， 19， 35 穩(wěn)定 D-DNA復(fù)合物 TF B 33 促進(jìn) RNA-pol 結(jié)合 TF F 30， 74 解螺旋酶 TF E 57()， 34( ) ATPase TF H 蛋白激酶，使 CTD磷酸化 3. 轉(zhuǎn)錄起始前復(fù)合物 (pre-initiation complex, PIC) 真核生物 RNA-pol不與 DNA分子直接 結(jié)合，而需依靠眾多的轉(zhuǎn)錄因子。 R N A p o l I I T F I I F TBP TAF T A T A D N A TF II A TF II B TF II E 轉(zhuǎn) 錄 前 起 始 復(fù) 合 物 TF II H 4. 拼

14、板理論 (piecing theory) 一個(gè)真核生物基因的轉(zhuǎn)錄需要 3至 5個(gè) 轉(zhuǎn)錄因子。轉(zhuǎn)錄因子之間互相結(jié)合，生成 有活性和專(zhuān)一性的復(fù)合物，再與 RNA聚合 酶搭配而有針對(duì)性地結(jié)合、轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的基 因。 （二）轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng) 真核生物轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)過(guò)程與原核生物大 致相似，但因有核膜相隔，沒(méi)有轉(zhuǎn)錄與翻 譯同步的現(xiàn)象。 RNA-pol前移處處都遇上核小體。 轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)過(guò)程中可以觀察到核小體移 位和解聚現(xiàn)象。 RNA-Pol RNA-Pol RNA-Pol 核小體 轉(zhuǎn) 錄 延 長(zhǎng) 中 的 核 小 體 移 位 轉(zhuǎn)錄方向 （三）轉(zhuǎn)錄終止 第三節(jié) 真核生物的轉(zhuǎn)錄后修飾 Post-transcriptional Mo

15、dification 一、 mRNA的轉(zhuǎn)錄后加工 (一 )首尾的修飾 1. 5-端加帽 ： m7GpppG 2. 3-端加尾 ： 多聚腺苷酸 (poly A) 帽子結(jié)構(gòu) 5 pppGp 5 GpppGp pppG PPi 鳥(niǎo)苷酸 轉(zhuǎn)移酶 5 m7GpppGp 甲基轉(zhuǎn)移酶 SAM 帽子結(jié)構(gòu)的生成 5 ppGp 磷酸酶 Pi 加帽過(guò)程 （二） mRNA的剪接 1. hnRNA 和 snRNA 核內(nèi)的初級(jí) mRNA稱(chēng)為雜化核 RNA (hetero-nuclear RNA, hnRNA) snRNA (small nuclear RNA) 核內(nèi)的蛋白質(zhì) 小分子核糖核酸蛋白體 （并接體 , splic

16、esome） snRNA 真核生物結(jié)構(gòu)基因，由若干個(gè)編碼區(qū)和非 編碼區(qū)互相間隔開(kāi)但又連續(xù)鑲嵌而成，去除非 編碼區(qū)再連接后，可翻譯出由連續(xù)氨基酸組成 的完整蛋白質(zhì)，這些基因稱(chēng)為斷裂基因。 斷裂基因 (splite gene) 非編碼區(qū) AG 編碼區(qū) 17 A B C D E F G L 1 2 3 4 5 6 77 7 0 0 b p 2. 外顯子 (exon)和內(nèi)含子 (intron) 外顯子 在斷裂基因及其初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上出 現(xiàn)，并表達(dá)為成熟 RNA的核酸序列。 內(nèi)含子 隔斷基因的線(xiàn)性表達(dá)而在剪接過(guò)程 中被除去的核酸序列。 雞卵清蛋白成熟 mRNA與 DNA雜交電鏡圖 雞卵清蛋白 基因 hnR

17、NA 首、尾修飾 hnRNA剪接 成熟的 mRNA 雞 卵 清 蛋 白 基 因 及 其 轉(zhuǎn) 錄、 轉(zhuǎn) 錄 后 修 飾 3. 內(nèi)含子的分類(lèi) I： 主要存在于線(xiàn)粒體 、 葉綠體及某些低 等真核生物的 rRNA基因； II： 也發(fā)現(xiàn)于線(xiàn)粒體 、 葉綠體 ， 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 是 mRNA； III： 是常見(jiàn)的形成套索結(jié)構(gòu)后剪接 ， 大 多數(shù) mRNA基因有此類(lèi)內(nèi)含子； IV： 是 tRNA基因及其初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中的 內(nèi)含子 ， 剪接過(guò)程需酶及 ATP。 Unit of transcription in a DNA strand Transcript modification 3 5 4. mRNA的剪接 除去

18、 hnRNA中的內(nèi)含子，將外顯子連接。 snRNP與 hnRNA結(jié)合成為并接體 二次轉(zhuǎn)酯反應(yīng) RNA編輯作用說(shuō)明，基因的編碼序列經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)錄 后加工，是可有多用途分化的，因此也稱(chēng)為分 化加工 (differential RNA processing)。 5. mRNA的編輯 (mRNA editing) 人類(lèi) apo B基因 mRNA（ 14500個(gè)核苷酸） 肝臟 apo B100 （分子量為 500 000） 小腸 apo B48 （分子量為 240 000） mRNA編輯 二、 tRNA的轉(zhuǎn)錄后加工 tRNA前體 TGGCNNAGTGC GGTTCGANNCC DNA RNAaseP、 內(nèi)切酶

19、 連接酶 tRNA核苷酸 轉(zhuǎn)移酶 堿基修飾 （ 2）還原反應(yīng) 如： U DHU （ 3）核苷內(nèi)的轉(zhuǎn)位反應(yīng) 如： U （ 4）脫氨反應(yīng) 如： A I 如： A Am （ 1）甲基化 （ 1） （ 1） （ 3） （ 2） （ 4） 三、 rRNA的轉(zhuǎn)錄后加工 轉(zhuǎn)錄 剪接 18S - rRNA 5.8S和 28S-rRNA rDNA 內(nèi)含子 內(nèi)含子 28S 5.8S 18S 45S - rRNA 四、核 酶 具有酶促活性的 RNA稱(chēng)為核酶。 核酶 (ribozyme) 四膜蟲(chóng) rRNA內(nèi)含子的二級(jí)結(jié)構(gòu) 最簡(jiǎn)單的核酶二級(jí)結(jié)構(gòu) 槌頭狀結(jié)構(gòu) (hammerhead structure) 底物部分 核酶研

20、究的意義 核酶的發(fā)現(xiàn)，對(duì)中心法則作了重要補(bǔ)充； 核酶的發(fā)現(xiàn)是對(duì)傳統(tǒng)酶學(xué)的挑戰(zhàn)； 利用核酶的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)合成人工核酶 。 人工設(shè)計(jì)的核酶 粗線(xiàn)表示合成的核酸分子 細(xì)線(xiàn)表示天然的核酸分子 X 表示一致性序列 箭頭表示切斷點(diǎn) 復(fù)習(xí)思考題： 1. 概念 （ 1）轉(zhuǎn)錄 （ 2）不對(duì)稱(chēng)轉(zhuǎn)錄 （ 3）結(jié)構(gòu)基因 （ 4）核心酶 （ 5）外顯子 （ 6）內(nèi)含子 （ 7）模板鏈 （ 8）啟動(dòng)子 （ 9）核酶 （ 10） Pribnow盒 2. 復(fù)制與轉(zhuǎn)錄的異同點(diǎn)。 3. RNA聚合酶與 DNA聚合酶作用的異同點(diǎn)。 4. 試述原核生物啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及功 能。 5. 原核生物與真核生物 RNA聚合酶有何異 同？ 6. 原核生物與真核生物的轉(zhuǎn)錄終止有何不 同