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1、RNA Biosynthesis (Transcription) The biochemistry and molecular biology department of CMU RNA 生物合成 (轉(zhuǎn)錄 ) 第十一章 轉(zhuǎn)錄（ transcription） 生物體以 DNA為模板合成 RNA的過程 。 轉(zhuǎn)錄 RNA DNA 轉(zhuǎn)錄與復制的相似點： 1. 模板均為 DNA； 2. 延長機理都是形成磷酸二酯鍵； 3. 方向均為 5 3。 轉(zhuǎn)錄和復制的區(qū)別 復制 轉(zhuǎn)錄 模板 DNA雙 鏈 DNA的 一條 鏈 原料 dNTP (N=A、 G、 C、 T) NTP(N=A、 G、 C、 U) 引物 需要
2、不 需要 酶 DNA聚合酶 RNA聚合酶 產(chǎn)物 DNA RNA 配對 A-T、 G-C A-U、 T-A、 G-C 參與轉(zhuǎn)錄的物質(zhì) 原料 : NTP（ ATP, UTP, GTP, CTP） 模板 : DNA 酶 : RNA聚合酶（ RNA polymerase, RNA-pol） 其他蛋白質(zhì)因子 第一節(jié) 轉(zhuǎn)錄的模板和酶 Templates of Transcription and Enzymes 一、轉(zhuǎn)錄模板 5 3 3 5 結(jié) 構(gòu) 基 因 （ s t r u c t u r a l g e n e ） 雙鏈 DNA分子中能作為模板轉(zhuǎn)錄出 RNA的那條鏈，稱為 模板鏈 。又叫有意 義鏈（ s
3、ense strand）或 Watson鏈。 另一條互補鏈稱為 編碼鏈 ，又叫反 義鏈（ antisense strand）或 Crick鏈。 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 RNA的堿基序列，除了 T 變 U 外，其余與編碼鏈相同。 G C A G T A C A T G T C5 3 3 C G T C A T G T A C A G 5 D N A 模 板 鏈 編 碼 鏈 轉(zhuǎn) 錄 R N A G C A G U A C A U G U C5 3 不對稱轉(zhuǎn)錄 (asymmetric transcription) 在 DNA分子雙鏈上某一區(qū)段，一股鏈 可轉(zhuǎn)錄，另一股鏈不轉(zhuǎn)錄； 模板鏈并非永遠在同一單鏈上。 二、
4、RNA聚合酶（ DDRP） 1. 原核生物的 RNA聚合酶 E.coli的 RNA聚合酶是由四種亞基 組成的六聚體（ 2 ） 核 心 酶 （ c o r e e n z y m e ）全 酶 （ h o l o e n z y m e ） RNA聚合酶全酶及核心酶電泳圖譜 E. coli RNA聚合酶組分 亞基 分子量 功 能 36512 決定哪些基因被轉(zhuǎn)錄 150618 催化功能 155613 結(jié)合 DNA模板 70263 辨認起始點 其他原核生物的 RNA聚合酶，在結(jié)構(gòu)、 組成、功能上均與 E.coli相似。 原核生物的 RNA聚合酶都受一類抗 結(jié)核藥 利福平 或 利福霉素 的特異性抑制。
5、 這類藥物能與 RNA聚合酶的 亞基特異結(jié) 合，從而影響酶的活性。 RNA聚合酶全酶在轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的結(jié)合 2. 真核生物的 RNA聚合酶 種類 I II III 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 45S-rRNA hnRNA 5S-rRNA tRNA, snRNA 對鵝膏蕈 堿的反應 不敏感 極敏感 中度敏感 RNA聚合酶 、 、 都由多個 亞基組成。有些亞基是三種酶所共有。 mRNA是各種 RNA中壽命最短、 最不穩(wěn)定的，需經(jīng)常重新合成。因此 RNA聚合酶 是三種酶中最活躍的。 三、酶與模板的辨認結(jié)合 原核生物一個轉(zhuǎn)錄區(qū)段可視為一個轉(zhuǎn) 錄單位，稱為 操縱子 (operon)，包括若干個 結(jié)構(gòu)基因 及其上游 (upst
6、ream)的 調(diào)控序列 。 RNA聚合酶結(jié)合模板 DNA的部位稱為 啟動子 (promoter)。是調(diào)控轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵部位。 5 3 3 5 調(diào) 控 序 列 結(jié) 構(gòu) 基 因 啟 動 子R N A - p o l RNA聚合酶 保護法 開始轉(zhuǎn)錄 T T G A C A A A C T G T -35 區(qū) T A T A A T Pu A T A T T A Py -10 區(qū) 1 -30 -50 10 -10 -40 -20 5 3 3 5 原核生物啟動子保守序列 5 5 RNA聚合酶保護區(qū) 結(jié)構(gòu)基因 3 3 N 1 7 T T A A C T N 7 A N 1 6 T A T G A T N 7
7、A N 1 7 T A T G T T N 6 A N 1 6 T A T A A T N 7 A N 1 8 T A C T G T N 6 A T T T A C A T T T A C A T T G A C A T T G A T A C T G A C G t r p t R N A T r p l a c r e c A a r a 區(qū) 區(qū)3 5 1 0 + 1 最 大 一 致 性 T T G A C A T A T A A T x / 4 5 3 8 3 6 2 9 3 7 3 7 2 8 4 0 2 5 3 0 4 1 2 9 4 4 原核生物啟動子 35區(qū)： 一致性序列為 T
8、TGACA 是 RNA-pol的 辨認位點 10區(qū)： 一致性序列為 TATAAT 又叫 Pribnow盒 是 RNA-pol的 結(jié)合位點 真核生物啟動子 結(jié) 構(gòu) 基 因 G C G C C A A T T A T A 內(nèi) 含 子外 顯 子 外 顯 子 轉(zhuǎn) 錄 起 始 C A A T 盒 G C 盒 增 強 子 順 式 作 用 元 件 T A T A 盒 ( H o g n e s s b o x ) 第二節(jié) 轉(zhuǎn)錄過程 The Process of Transcription 分為三個階段： 起始 (initiation) 延長 (elongation) 終止 (termination) 一、原
9、核生物的轉(zhuǎn)錄過程 （一）轉(zhuǎn)錄起始 1. RNA聚合酶結(jié)合在轉(zhuǎn)錄模板的起始區(qū) 域。 2. DNA雙鏈解開，以一條鏈為模板，合 成第一個磷酸二酯鍵。 2. DNA雙鏈解開。 1. RNA聚合酶全酶 (2)與模板結(jié)合。 3. 在 RNA聚合酶作用下發(fā)生第一次聚合反 應，形成轉(zhuǎn)錄起始復合物。 5-pppG -OH + NTP 5-pppGpN - OH 3 + PPi 轉(zhuǎn)錄起始過程 RNApol (2) - DNA - pppGpN- OH 3 轉(zhuǎn)錄起始復合物 （二）轉(zhuǎn)錄延長 1. 亞基脫落， RNApol聚合酶核心酶變 構(gòu)，與模板結(jié)合松弛，沿著 DNA模板前 移； 2. 在 核心酶 作用下， NTP
10、不斷聚合， RNA鏈不斷延長。 (NMP) n + NTP (NMP) n+1 + PPi 轉(zhuǎn)錄泡 （ transcription bubble） ： 在轉(zhuǎn)錄延長過程中，由局部打開的 DNA雙鏈 、 RNA聚合酶核心酶 及新生成 的 RNA三者結(jié)合在一起的復合體，為空 泡狀結(jié)構(gòu)，又稱轉(zhuǎn)錄復合物。 電鏡下原核生物轉(zhuǎn)錄過程中的羽毛狀現(xiàn)象 轉(zhuǎn)錄未完成，翻譯已開始進行。 轉(zhuǎn)錄的起始及延長過程 (三 ) 轉(zhuǎn)錄終止 RNA聚合酶在 DNA模板上停頓下 來，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 RNA鏈從轉(zhuǎn)錄復合物上脫 落下來。 分類： 依賴 Rho ()因子的轉(zhuǎn)錄終止 非依賴 Rho因子的轉(zhuǎn)錄終止 1. 依賴 因子的轉(zhuǎn)錄終止 因子是
11、同六聚體蛋白； 因子能結(jié)合 RNA，與 poly C的結(jié)合力最 強； 因子還有 ATP酶和解螺旋酶的活性。 2. 不依賴 因子的轉(zhuǎn)錄終止 DNA模板上靠近終止處，有特殊的堿 基序列，轉(zhuǎn)錄出 RNA后， RNA產(chǎn)物形成特 殊的結(jié)構(gòu)來終止轉(zhuǎn)錄。 莖環(huán)結(jié)構(gòu)終止轉(zhuǎn)錄的機理 使 RNA聚合酶變構(gòu)，轉(zhuǎn)錄停頓； 使轉(zhuǎn)錄復合物趨于解離， RNA產(chǎn)物釋 放。 二、真核生物的轉(zhuǎn)錄過程 （一）轉(zhuǎn)錄起始 真核生物的轉(zhuǎn)錄起始上游區(qū)段比原核 生物多樣化 ， 轉(zhuǎn)錄起始時 ， RNA-pol不 直接結(jié)合模板 ， 其起始過程比原核生物 復雜 。 轉(zhuǎn)錄起始點 TATA盒 CAAT盒 GC盒 增強子 順式作用元件 (cis-act
12、ing element) 1. 轉(zhuǎn)錄起始前的上游區(qū)段 AATAAA 切離加尾 轉(zhuǎn)錄終止點 修飾點 外顯子 翻譯起始點 內(nèi) 含 子 OCT-1 OCT-1： ATTTGCAT八聚體 2. 轉(zhuǎn)錄因子 能直接或間接辨認和結(jié)合轉(zhuǎn)錄上游區(qū) 段 DNA的蛋白質(zhì)，統(tǒng)稱為 反式作用因子 (trans-acting factors)。 反式作用因子中，直接或間接結(jié)合 RNA聚合酶的，則稱為 轉(zhuǎn)錄因子 (trans- criptional factors, TF)。 參與 RNA-pol 轉(zhuǎn)錄的 TF 轉(zhuǎn)錄因子 亞基和 (或 )分子量（ kDa） 功能 TF D TBP， 38 結(jié)合 TATA盒 TAF 輔助 T
13、BP-DNA結(jié)合 TF A 12， 19， 35 穩(wěn)定 D-DNA復合物 TF B 33 促進 RNA-pol 結(jié)合 TF F 30， 74 解螺旋酶 TF E 57()， 34( ) ATPase TF H 蛋白激酶，使 CTD磷酸化 3. 轉(zhuǎn)錄起始前復合物 (pre-initiation complex, PIC) 真核生物 RNA-pol不與 DNA分子直接 結(jié)合，而需依靠眾多的轉(zhuǎn)錄因子。 R N A p o l I I T F I I F TBP TAF T A T A D N A TF II A TF II B TF II E 轉(zhuǎn) 錄 前 起 始 復 合 物 TF II H 4. 拼
14、板理論 (piecing theory) 一個真核生物基因的轉(zhuǎn)錄需要 3至 5個 轉(zhuǎn)錄因子。轉(zhuǎn)錄因子之間互相結(jié)合，生成 有活性和專一性的復合物，再與 RNA聚合 酶搭配而有針對性地結(jié)合、轉(zhuǎn)錄相應的基 因。 （二）轉(zhuǎn)錄延長 真核生物轉(zhuǎn)錄延長過程與原核生物大 致相似，但因有核膜相隔，沒有轉(zhuǎn)錄與翻 譯同步的現(xiàn)象。 RNA-pol前移處處都遇上核小體。 轉(zhuǎn)錄延長過程中可以觀察到核小體移 位和解聚現(xiàn)象。 RNA-Pol RNA-Pol RNA-Pol 核小體 轉(zhuǎn) 錄 延 長 中 的 核 小 體 移 位 轉(zhuǎn)錄方向 （三）轉(zhuǎn)錄終止 第三節(jié) 真核生物的轉(zhuǎn)錄后修飾 Post-transcriptional Mo
15、dification 一、 mRNA的轉(zhuǎn)錄后加工 (一 )首尾的修飾 1. 5-端加帽 ： m7GpppG 2. 3-端加尾 ： 多聚腺苷酸 (poly A) 帽子結(jié)構(gòu) 5 pppGp 5 GpppGp pppG PPi 鳥苷酸 轉(zhuǎn)移酶 5 m7GpppGp 甲基轉(zhuǎn)移酶 SAM 帽子結(jié)構(gòu)的生成 5 ppGp 磷酸酶 Pi 加帽過程 （二） mRNA的剪接 1. hnRNA 和 snRNA 核內(nèi)的初級 mRNA稱為雜化核 RNA (hetero-nuclear RNA, hnRNA) snRNA (small nuclear RNA) 核內(nèi)的蛋白質(zhì) 小分子核糖核酸蛋白體 （并接體 , splic
16、esome） snRNA 真核生物結(jié)構(gòu)基因，由若干個編碼區(qū)和非 編碼區(qū)互相間隔開但又連續(xù)鑲嵌而成，去除非 編碼區(qū)再連接后，可翻譯出由連續(xù)氨基酸組成 的完整蛋白質(zhì)，這些基因稱為斷裂基因。 斷裂基因 (splite gene) 非編碼區(qū) AG 編碼區(qū) 17 A B C D E F G L 1 2 3 4 5 6 77 7 0 0 b p 2. 外顯子 (exon)和內(nèi)含子 (intron) 外顯子 在斷裂基因及其初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上出 現(xiàn)，并表達為成熟 RNA的核酸序列。 內(nèi)含子 隔斷基因的線性表達而在剪接過程 中被除去的核酸序列。 雞卵清蛋白成熟 mRNA與 DNA雜交電鏡圖 雞卵清蛋白 基因 hnR
17、NA 首、尾修飾 hnRNA剪接 成熟的 mRNA 雞 卵 清 蛋 白 基 因 及 其 轉(zhuǎn) 錄、 轉(zhuǎn) 錄 后 修 飾 3. 內(nèi)含子的分類 I： 主要存在于線粒體 、 葉綠體及某些低 等真核生物的 rRNA基因； II： 也發(fā)現(xiàn)于線粒體 、 葉綠體 ， 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 是 mRNA； III： 是常見的形成套索結(jié)構(gòu)后剪接 ， 大 多數(shù) mRNA基因有此類內(nèi)含子； IV： 是 tRNA基因及其初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中的 內(nèi)含子 ， 剪接過程需酶及 ATP。 Unit of transcription in a DNA strand Transcript modification 3 5 4. mRNA的剪接 除去
18、 hnRNA中的內(nèi)含子，將外顯子連接。 snRNP與 hnRNA結(jié)合成為并接體 二次轉(zhuǎn)酯反應 RNA編輯作用說明，基因的編碼序列經(jīng)過轉(zhuǎn)錄 后加工，是可有多用途分化的，因此也稱為分 化加工 (differential RNA processing)。 5. mRNA的編輯 (mRNA editing) 人類 apo B基因 mRNA（ 14500個核苷酸） 肝臟 apo B100 （分子量為 500 000） 小腸 apo B48 （分子量為 240 000） mRNA編輯 二、 tRNA的轉(zhuǎn)錄后加工 tRNA前體 TGGCNNAGTGC GGTTCGANNCC DNA RNAaseP、 內(nèi)切酶
19、 連接酶 tRNA核苷酸 轉(zhuǎn)移酶 堿基修飾 （ 2）還原反應 如： U DHU （ 3）核苷內(nèi)的轉(zhuǎn)位反應 如： U （ 4）脫氨反應 如： A I 如： A Am （ 1）甲基化 （ 1） （ 1） （ 3） （ 2） （ 4） 三、 rRNA的轉(zhuǎn)錄后加工 轉(zhuǎn)錄 剪接 18S - rRNA 5.8S和 28S-rRNA rDNA 內(nèi)含子 內(nèi)含子 28S 5.8S 18S 45S - rRNA 四、核 酶 具有酶促活性的 RNA稱為核酶。 核酶 (ribozyme) 四膜蟲 rRNA內(nèi)含子的二級結(jié)構(gòu) 最簡單的核酶二級結(jié)構(gòu) 槌頭狀結(jié)構(gòu) (hammerhead structure) 底物部分 核酶研
20、究的意義 核酶的發(fā)現(xiàn)，對中心法則作了重要補充； 核酶的發(fā)現(xiàn)是對傳統(tǒng)酶學的挑戰(zhàn)； 利用核酶的結(jié)構(gòu)設計合成人工核酶 。 人工設計的核酶 粗線表示合成的核酸分子 細線表示天然的核酸分子 X 表示一致性序列 箭頭表示切斷點 復習思考題： 1. 概念 （ 1）轉(zhuǎn)錄 （ 2）不對稱轉(zhuǎn)錄 （ 3）結(jié)構(gòu)基因 （ 4）核心酶 （ 5）外顯子 （ 6）內(nèi)含子 （ 7）模板鏈 （ 8）啟動子 （ 9）核酶 （ 10） Pribnow盒 2. 復制與轉(zhuǎn)錄的異同點。 3. RNA聚合酶與 DNA聚合酶作用的異同點。 4. 試述原核生物啟動子的結(jié)構(gòu)特點及功 能。 5. 原核生物與真核生物 RNA聚合酶有何異 同？ 6. 原核生物與真核生物的轉(zhuǎn)錄終止有何不 同
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