生物化學(xué)總結(jié)：第十三章DNA的復(fù)制和修復(fù)

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1、第十三章 DNA的復(fù)制和修復(fù) 生物體的遺傳信息儲存在DNA中，并通過DNA的復(fù)制由親代傳給子代。在子代的生長發(fā)育中遺傳信息自DNA轉(zhuǎn)錄給RNA，然后翻譯成蛋白質(zhì)以執(zhí)行各種生命功能，使后代表現(xiàn)出與親代相似的遺傳性狀。 1958年，F(xiàn).Crick提出中心法則： （1）以原DNA分子為模板，合成出相同DNA分子的過程。 （2）以某一段DNA分子為模板，合成出與其序列對應(yīng)的RNA分子的過程。 （3）以mRNA為模板，根據(jù)三聯(lián)密碼規(guī)則，合成對應(yīng)蛋白質(zhì)的過程。 中心法則揭示了生物體內(nèi)遺傳信息的傳遞方向。 圖 DNA生物合成有兩種方式：DNA復(fù)制和反轉(zhuǎn)錄 DNA體內(nèi)復(fù)制涉及

2、：原核、真核生物的染色體、細(xì)菌質(zhì)粒（環(huán)狀，雙鏈）、真核細(xì)胞器DNA（線粒體、葉綠體）、病毒（雙鏈，環(huán)狀） DNA的體外復(fù)制：分子克隆。 第一節(jié) DNA的復(fù)制 一、 DNA半保留復(fù)制 1953年，Watson和Crick在提出DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型時(shí)就推測DNA可能按照半保留機(jī)制進(jìn)行自我復(fù)制。 P321 圖191 Watson和Crick提出的DNA雙螺旋復(fù)制模型 在復(fù)制過程中，首先親代雙鏈解開，然后每條鏈作為模板，在其上合成互補(bǔ)的子代鏈，結(jié)果新形成的兩個(gè)子代DNA與親代DNA分子的堿基順序完全一樣，而且每個(gè)子代DNA分子中有一條鏈完全來自親代DNA，另一條是新合成的。 1958

3、年，Meselson和Stahl用15N標(biāo)記E.coli. DNA，證明了DNA的復(fù)制是半保留復(fù)制。 P322 圖19-2 DNA的半保留復(fù)制。 1963年，Cairns用放射自顯影法，在顯微鏡下首次觀察到完整的正在復(fù)制的E. coli. 染色體DNA。 P323 圖 19-3 3H-脫氧胸苷標(biāo)記E.coli. DNA ，經(jīng)過將近兩代時(shí)間，用溶菌酶消化細(xì)胞壁，將E.coli. DNA轉(zhuǎn)至膜上，干燥，壓感光膠片，3H放出β粒子，還原銀，在光學(xué)顯微鏡下觀察。用這種方法證明了大腸桿菌染色體DNA是一個(gè)環(huán)狀分子，并以半保留的形式進(jìn)行復(fù)制。 DNA的半保留復(fù)制可以說明DNA在代謝

4、上的穩(wěn)定性。經(jīng)過多代復(fù)制，DNA的多核苷酸鏈仍可以保持完整，并存在于后代而不被分解掉。 二、 復(fù)制起點(diǎn)、單位和方向 DNA的復(fù)制是在起始階段進(jìn)行控制的，一旦復(fù)制起始，它就會繼續(xù)下去直到整個(gè)復(fù)制子完成復(fù)制。 1、 復(fù)制起點(diǎn) 復(fù)制起點(diǎn)是以一條鏈為模板起始DNA合成的一段序列。有時(shí)，兩條鏈的復(fù)制起點(diǎn)并不總是在同一點(diǎn)上（如D環(huán)復(fù)制）。 在一個(gè)完整的細(xì)胞周期中，每一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)只使用一次，完成一次復(fù)制過程。 多數(shù)生物的復(fù)制起點(diǎn)，都是DNA呼吸作用強(qiáng)烈（甲醛變性實(shí)驗(yàn)）的區(qū)段，即經(jīng)常開放的區(qū)段，富含A.T。 ★環(huán)狀DNA復(fù)制起點(diǎn)的確定方法 P325 圖19-6 ★復(fù)制起點(diǎn)的克隆和功能分析

5、——重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化法 大腸桿菌的復(fù)制起點(diǎn)oriC區(qū)1Kb的重組質(zhì)粒在轉(zhuǎn)化子中的復(fù)制行為與其染色體一樣，受到嚴(yán)密控制，每個(gè)細(xì)胞只有1-2個(gè)拷貝，用核酸外切酶縮短oriC克隆片段的大小，最后得到245bp的基本功能區(qū)，攜帶它的質(zhì)粒依然能夠自我復(fù)制，拷貝數(shù)可以增加到20以上，這說明發(fā)動(dòng)復(fù)制的序列在245bp的基本功能區(qū)，而決定拷貝數(shù)的序列在基本功能區(qū)之外和1Kb之間。 鼠傷寒沙門氏菌的起點(diǎn)位于一段296bp的DNA片段上，與大腸桿菌的復(fù)制起始區(qū)有86%同源性，而且有些親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的細(xì)菌，其復(fù)制起點(diǎn)在大腸桿菌中亦能起作用。因此，復(fù)制起始區(qū)的結(jié)構(gòu)可能是很保守的。 起始序列含有一系列對稱的反向重復(fù)和某

6、些短的成簇的保守序列。 2、 復(fù)制單位 復(fù)制子(Replicon)：Genome能獨(dú)立進(jìn)行復(fù)制的單位，每個(gè)復(fù)制子都含有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)。 原核生物的染色體和質(zhì)粒、真核生物的細(xì)胞器DNA都是環(huán)狀雙鏈分子，它們都是單復(fù)制子，都在一個(gè)固定的起點(diǎn)開始復(fù)制，復(fù)制方向大多數(shù)是雙向的，少數(shù)是單向復(fù)制。多數(shù)是對稱復(fù)制，少數(shù)是不對稱復(fù)制（一條鏈復(fù)制后才進(jìn)行另一條鏈的復(fù)制）。 環(huán)狀DNA的復(fù)制眼象θ，稱θ形復(fù)制。 真核生物的染色體DNA是線形雙鏈分子，含有許多復(fù)制起點(diǎn)，因此是多復(fù)制子，每個(gè)復(fù)制子約有100-200Kbp。人體細(xì)胞平均每個(gè)染色體含有1000個(gè)復(fù)制子。 病毒DNA多種多樣，環(huán)狀或線形，雙鏈或單

7、鏈，但都是單復(fù)制子。 3、 復(fù)制方向 定點(diǎn)起始，復(fù)制方向大多數(shù)是雙向的（等速進(jìn)行或異速進(jìn)行），形成兩個(gè)復(fù)制叉，少數(shù)是單向復(fù)制，形成一個(gè)復(fù)制叉。 ★用放射自顯影實(shí)驗(yàn)判斷DNA的復(fù)制方向及速度 低放射性3H-脫氧胸苷 高放射性3H-脫氧胸苷 a. 單向 b. 雙向等速 三種結(jié)果圖形 c. 雙向異速 E.coli.的一個(gè)溫度敏感株，在42℃時(shí)，能使DNA在完成復(fù)制后，不再開始新的復(fù)制過程，而在25℃時(shí)復(fù)制功又能能恢復(fù)。 4、 DNA的幾種復(fù)制方式 （1）、 直線雙向復(fù)制 單點(diǎn)，雙向，T7 多點(diǎn)，雙向，真核染色體DNA （2）、 θ型復(fù)制：環(huán)狀雙鏈DNA，單向

8、或雙向（E .coli.） （3）、 滾環(huán)復(fù)制：環(huán)狀單鏈DNA，Φx174 （4）、 D環(huán)復(fù)制：線粒體、葉綠體DNA （5）、 多復(fù)制叉復(fù)制： 第一輪復(fù)制尚未完成，復(fù)制起點(diǎn)就開始第二輪的復(fù)制。 在E.coli.富營養(yǎng)時(shí)，可采取多復(fù)制叉復(fù)制方式。E.coli. DNA的復(fù)制最快可達(dá)50Kb/min，完全復(fù)制需40min，富營養(yǎng)時(shí)，20min分裂。而真核染色體要6-8小時(shí)。 三、 與DNA復(fù)制有關(guān)的酶及蛋白質(zhì)因子 目前已發(fā)現(xiàn)30多種酶及蛋白質(zhì)因子參與DNA復(fù)制 （一） DNA的聚合反應(yīng)和聚合酶 DNA生物合成5，→3，，化學(xué)合成3，→5， 1、 DNA聚合反應(yīng)必備的條件 ⑴

9、DNA聚合酶 ⑵ DNA模板(反轉(zhuǎn)錄時(shí)用RNA模板) ⑶引物 (DNA、RNA或蛋白質(zhì)) ⑷ 4種dNTP ⑸ Mg2+ 2、 聚合反應(yīng)過程及特點(diǎn) 總反應(yīng)式： n1dATP DNA pol . dAMP n2dGTP +DNA dGMP DNA+（n1+n2+n3+n4）PPi n3dCTP Mg2+ dCMP n4dTTP dTMP P329 圖19-10 P330圖1

10、9-11 在鏈的延長過程中，鏈的游離3，-羥基，對進(jìn)入的脫氧核糖核苷三磷酸α磷原子發(fā)生親核攻擊，生成3，.5，-磷酸二酯鍵，并脫下焦磷酸。 DNA聚合酶的反應(yīng)特點(diǎn)： ⑴ 以4種dNTP為底物 ⑵ 反應(yīng)需要接受模板的指導(dǎo)，不能催化游離的dNTP的聚合。 ⑶ 反應(yīng)需有引物3，-羥基存在 ⑷ 鏈生長方向5， → 3， ⑸ 產(chǎn)物DNA的性質(zhì)與模板相同 3、 由DNA聚合酶催化的幾種DNA聚合類型 P331圖19-12 （1） 發(fā)莢環(huán)結(jié)構(gòu)：加入單鏈DNA作為模板和引物，3＇羥基端回折成引物鏈。 （2） 末端延伸聚合：加入雙鏈DNA作為模板和引物，3’末

11、端突出作為模板。 （3） 分枝型和切口平移型聚合：加入雙鏈DNA，聚合發(fā)生在切口或末端單鏈區(qū)。 （4） 環(huán)形聚合：加入帶引物的環(huán)形DNA作為模板。 4、 E.coli DNA聚合酶 （1）、 E.coli. DNA pol.I（Kornberg酶，400 copy/cell） 單體酶，分子量109Kd，含一個(gè)Zn2+，每個(gè)細(xì)胞中含400個(gè)DNA pol.Ⅰ 催化活性： 5， → 3， 聚合活性 3， → 5， 外切活性 5， → 3， 外切活性 用蛋白水解酶將DNA pol.Ⅰ部分水解可得： 大片段（Klenow），75Kd，活性：5， → 3，聚合活性、3， → 5，

12、外切活性。 小片段，36Kd，活性：5， → 3，外切活性（只作用于雙鏈DNA的堿基配對部分，切除修復(fù)）。 Klenow片段的用途： a 補(bǔ)齊DNA 3，隱縮未端 b. 標(biāo)記DNA片段未端 c．cDNA合成第二鏈 d．d DNA測序 （2）、 E.coli. DNA Pol.Ⅱ（100 copy/cell） 單體酶，分子量120Kd 催化活性：5，→ 3，聚合(活性很低) 3，→ 5，外切 可能在DNA的修復(fù)中起某中作用。 （3）、 E.coli.DNA pol.Ⅲ（復(fù)制酶，10-20 copy/cell） 寡聚酶，全酶由10種共22個(gè)亞基組

13、成，α、ε和θ三種亞基組成核心酶。 P334表10-3 DNA pol.Ⅲ是合成新鏈DNA主要的酶，又稱復(fù)制酶(Replicase) Pol.Ⅲ的5，→3，外切酶活性只作用于單鏈DNA。 P334 表19-2 E.coli三種DNA聚合酶的性質(zhì)比較 ★DNA聚合酶有6個(gè)結(jié)合位點(diǎn) ⑴ 模板DNA結(jié)合位點(diǎn) ⑵ 引物結(jié)合位點(diǎn) ⑶ 引物3，-OH位點(diǎn)、反應(yīng)位點(diǎn) ⑷ 底物dNTP結(jié)合位點(diǎn) ⑸ 5， → 3， 外切位點(diǎn)(pol.Ⅱ沒有) ⑹ 3， → 5， 外切位點(diǎn)(校正) 5、 真核生物DNA聚合酶

14、 P334 表19-4 真核生物DNA聚合酶 真核DNA聚合酶一般不具備外切活力，可能由另外的酶在DNA復(fù)制中起校正功能。 ⑴ DNA聚合酶α，多亞基，功能與E.coli. pol.Ⅲ類似，是真核DNA復(fù)制酶。 ⑵ DNA聚合酶β，主要在DNA損傷的修復(fù)中起作用。 ⑶ DNA聚合酶γ，從線粒體得到，可能與線粒體DNA的復(fù)制有關(guān)。 ⑷ DNA聚合酶δ，特點(diǎn)：有3， → 5，外切活力。 （二） 引物酶或RNA聚合酶（引發(fā)酶） 細(xì)胞內(nèi)，DNA的復(fù)制需要引物（DNA或RNA），引物酶或RNA聚合酶可合成6-10個(gè)堿基的RNA引物。 ★DNA復(fù)制為什么要用

15、RNA引物？（為什么DNA聚合酶要用引物，RNA聚合酶不需要引物？） P338 ⑴從模板復(fù)制最初幾個(gè)核酸時(shí)，堿基堆集力和氫鍵都較弱，易發(fā)生錯(cuò)配 ⑵新復(fù)制的最初幾個(gè)核苷酸，沒有與模板形成穩(wěn)定雙鏈，DNA聚合酶的5，→3，校對功能難發(fā)揮作用。 （三） 解螺旋酶 大腸桿菌的解螺旋酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ與rep蛋白共同作用，將DNA兩條鏈解開。 解螺旋酶I、II、III沿著模板鏈的5’→3’方向隨著復(fù)制叉的前進(jìn)而移動(dòng)，而rep蛋白則在另一條模板鏈上沿3’→5’方向移動(dòng)。 （四） DNA旋轉(zhuǎn)酶 屬DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ，可引入負(fù)超螺旋，消除復(fù)制叉前進(jìn)時(shí)帶來的扭曲張力。 拓?fù)洚悩?gòu)酶分兩類：I和II，廣

16、泛存在于原核生物和真核生物。 拓?fù)洚悩?gòu)酶I使DNA的一條鏈發(fā)生斷裂和再連接，反應(yīng)無須供給能量，主要集中在活性轉(zhuǎn)錄區(qū)，與轉(zhuǎn)錄有關(guān)。 拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ使DNA的兩條鏈同時(shí)斷裂和再連接，當(dāng)它引入超螺旋時(shí)需要由ATP供給能量。分布在染色質(zhì)骨架蛋白和核基質(zhì)部，與復(fù)制有關(guān)。 （五） 單鏈DNA結(jié)合蛋白（SSB） 復(fù)制叉上的解螺旋酶，沿雙鏈DNA前進(jìn)，產(chǎn)生單鏈區(qū)，大量的單鏈DNA結(jié)合蛋白與單鏈區(qū)結(jié)合，阻止復(fù)性和保護(hù)單鏈DNA不被核酸酶降解。 （六） DNA連接酶（ligase） 連接雙鏈DNA上的切口。 大腸桿菌連接酶只能在模板上連接DNA缺口。T4DNA ligase即可連接粘性末端的DNA，又

17、可連接平齊末端的雙鏈DNA。 E.coli.和其它細(xì)菌的DNA ligase以NAD為能源，動(dòng)物細(xì)胞和噬菌體DNA ligase以ATP為能源。 （七） DNA復(fù)制的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu) P338-339 四、 DNA的半不連續(xù)復(fù)制 P336 圖19-15 DNA的半不連續(xù)復(fù)制 DNA聚合酶催化的方向是5，→3，。 前導(dǎo)鏈： 滯后鏈： 1968年，發(fā)現(xiàn)岡崎片段。長度： 細(xì)菌：1Kb-2Kb，相當(dāng)于一個(gè)順反子的大小。 真核：100-200bp，約等于一個(gè)核小體DNA的長度。 五、 DNA復(fù)制過程（E.coli.） P342 圖19-17 大腸桿菌的復(fù)制體結(jié)構(gòu)示意圖

18、 1、 復(fù)制的起始 引發(fā)：當(dāng)DNA的雙螺旋解開后，合成RNA引物的過程。 引發(fā)體：引物合成酶與各種蛋白質(zhì)因子（dnaB、dnaC、n、n＇n＇＇I）構(gòu)成的復(fù)合體，負(fù)責(zé)RNA引物的合成。 引發(fā)體沿著模板鏈5’→3’方向移動(dòng)（與岡崎片段合成的方向正好相反，而與復(fù)制叉移動(dòng)的方向相同），移到一定位置上即可引發(fā)RNA引物的合成。 E.coli.DNA復(fù)制原點(diǎn)ori C，由245bp組成，三組13bp重復(fù)序列（近5，端處），四組9 bp重復(fù)序列（另一端處）。 圖 大腸桿菌復(fù)制原點(diǎn)起始復(fù)制所需蛋白質(zhì)： DNaA 在原點(diǎn)處打開雙螺旋 DNaB

19、 使DNA解旋 DNaC DNaB結(jié)合在原點(diǎn)所需 Hu 刺激起始 引物酶（DNaG） 合成RNA引物 SSB 結(jié)合單鏈DNA RNA聚合酶 促進(jìn)DNaA活性 旋轉(zhuǎn)酶 松馳DNA扭曲應(yīng)力 20個(gè)DnaA結(jié)合在四組9bp重復(fù)區(qū)，形成起始復(fù)合物，DNA環(huán)繞此復(fù)合物。 三組13bp重復(fù)區(qū)依次變性，產(chǎn)生開放型復(fù)合物。 DnaB（在DnaC協(xié)助下）與開放復(fù)合物結(jié)合，進(jìn)一步解鏈。 2、 DNA鏈的延長反應(yīng)

20、前導(dǎo)鏈只需要一個(gè)RNA引物，后隨鏈的每一個(gè)岡崎片段都需要一個(gè)RNA引物，鏈的延長反應(yīng)由DNA pol.Ⅲ催化。 復(fù)制體：在DNA合成的生長點(diǎn)（既復(fù)制叉上）分布著許多與復(fù)制有關(guān)的酶和輔助因子，它們在DNA的模板鏈形成離散的復(fù)合物，彼此配合進(jìn)行高度精確的復(fù)制，稱為復(fù)制體。 復(fù)制體沿著復(fù)制叉方向前進(jìn)就合成DNA。 3、 RNA引物的切除及缺口補(bǔ)齊 DNA polⅠ的5， → 3，外切活力，切除RNA引物。 DNApolⅠ的5， → 3，合成活性補(bǔ)齊缺口。 4、 DNA切口的連接 DNA ligase，動(dòng)物、真核由ATP供能，原核由NAD供能。 5、 DNA合成的終止 環(huán)狀DNA、線

21、性DNA，復(fù)制叉相遇即終止。 u 小結(jié)： ⑴ DNA解螺旋酶解開雙鏈DNA。 ⑵ SSB結(jié)合于DNA單鏈。 ⑶ DNA旋轉(zhuǎn)酶引入負(fù)超螺旋，消除復(fù)制叉前進(jìn)時(shí)帶來的扭曲張力。 ⑷ DNA引物酶(在引發(fā)體中)合成RNA引物。 ⑸ DNA pol.Ⅲ在兩條新生鏈上合成DNA。 ⑹ DNA polⅠ切除RNA引物，并補(bǔ)上DNA。 ⑺ DNA ligase連接一個(gè)岡崎片段。 DNA復(fù)制過程中，聚合酶對dTTP和dUTP的分辨能力高,有少量dUTP摻入DNA鏈中，此時(shí)，U-糖苷酶、AP內(nèi)切酶、DNA polⅠ、DNA ligase共同作用，切除尿嘧啶，接上正確的堿基。 六、 真核生物

22、DNA的復(fù)制 P343 1、 復(fù)制起點(diǎn)和單位 真核生物染色體DNA是多復(fù)制子，有多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，可以多點(diǎn)起始，分段進(jìn)行復(fù)制。每個(gè)復(fù)制子大多在100-200bp之間，比細(xì)菌染色體DNA（單復(fù)制子）小得多。 ★試驗(yàn)證據(jù)：5-氟脫氧胞苷標(biāo)記 真核生物DNA復(fù)制叉移動(dòng)的速度此原核的慢，如哺乳動(dòng)物復(fù)制叉移動(dòng)的速度每分鐘1-3Kb，細(xì)菌每分鐘5Kb。 真核生物染色體全部復(fù)制完成前，起點(diǎn)不再從新開始復(fù)制。而在快速生長的原核生物中，起點(diǎn)可以連續(xù)發(fā)動(dòng)復(fù)制。真核生物在快速生長時(shí)，可采用更多的復(fù)制起點(diǎn)同時(shí)復(fù)制。如黑腹果蠅，早期胚胎細(xì)胞中相鄰復(fù)制起點(diǎn)的平均距離為7.9kb，而在培養(yǎng)的成體細(xì)胞中，

23、平均距離為40kb，成體細(xì)胞只利用一部分復(fù)制起點(diǎn)。 2、 復(fù)制過程中組蛋白的裝配 核小體的結(jié)構(gòu)（200bp左右） 在真核生物的復(fù)制子上，親代染色體的核小體被逐個(gè)打開，組蛋白以完整的八聚體形式直接轉(zhuǎn)移到子代DNA的前導(dǎo)鏈上，新合成的組蛋白與后隨鏈組裝成核小體。因此，DNA的復(fù)制是半保留的，而組蛋白則是全保留的。 ★試驗(yàn)證據(jù)：環(huán)己酮亞胺抑制組蛋白合成，電子顯微鏡下觀察 3、 真核生物DNA復(fù)制的終止 端粒：一段DNA序列與蛋白質(zhì)形成的一種復(fù)合體，是真核細(xì)胞染色體末端所特有的結(jié)構(gòu)。 功能： ⑴保證線性DNA的完整復(fù)制 ⑵保護(hù)染色體末端 ⑶決定細(xì)胞壽命，胚系細(xì)胞含端粒酶，體細(xì)胞不表

24、達(dá)端粒酶。 端粒（telomeres）分布于線性真核染色體未端。酵母端粒約100bp的重復(fù)序列，形式為：5，（TxGy）n3，(AxCy) n，x和y一般為1—4。 端粒末端的重復(fù)序列，通過端粒酶（telomerase）將其加到染色體末端。 端粒酶含有RNA和蛋白質(zhì)（起DNA聚合酶的作用）兩種組分，RNA分子約159b，含有多個(gè)CyAx重復(fù)序列，RNA分子用作端粒TxGy鏈合成的模板。端粒酶是一種反轉(zhuǎn)錄酶，它只合成與酶自身的RNA模板互補(bǔ)的DNA片段。 人類體細(xì)胞的端粒長度，隨個(gè)體年齡增加而逐漸縮短。細(xì)胞每分裂一次，端粒縮短50-200bp，短至1-4Kbp時(shí)，細(xì)胞就停止分裂。若能重建

25、端粒，則細(xì)胞可以永遠(yuǎn)分裂。惡性腫瘤細(xì)胞端酶表達(dá)多。 ⑴雜交 圖 ⑵聚合 圖 ⑶轉(zhuǎn)位再雜交 圖 ⑷進(jìn)一步聚合 圖 ⑸非標(biāo)準(zhǔn)GG配對 圖 七、 DNA復(fù)制的調(diào)控 八、 DNA復(fù)制的真實(shí)性 《楊岐生》P144 生物體DNA復(fù)制具有高度真實(shí)性，復(fù)制107-1011堿基對,只有一個(gè)錯(cuò)誤堿基。 堿基對的自由能通常在4-13KJ/mol，這樣的自由能相當(dāng)于平均參入100個(gè)核苷酸就可能出現(xiàn)一次錯(cuò)配，僅靠Watson-Crick雙螺旋的堿基配對原則，突變率將高達(dá)10-2 。 1、 DNA聚合酶對堿基的選擇作

26、用 酶的被動(dòng)論：不同的核苷酸在聚合位點(diǎn)停留時(shí)間不同，正確的dNTP能長時(shí)間停留，而參與聚合。DNA聚合酶能依照模板的核苷酸，選擇正確的dNTP摻入引物末端。 酶積極參與理論：DNA聚合酶對正確與錯(cuò)誤的核苷酸，不僅親和性不同，而且將它們插入DNA引物端的速度也不同。 動(dòng)力學(xué)校正閱讀：在新的磷酸二酯鍵未形成時(shí)，dNTP結(jié)合在酶與模板—引物復(fù)合物的聚合位點(diǎn)上，DNA聚合酶能識別正確與錯(cuò)誤的dNTP。 DNA聚合酶對底物的識別作用，DNA聚合酶有兩種底物，一種是DNA模板—引物，另一種是dNTP。 DNA聚合酶先識別DNA模板和引物的3，未端，再識別底物dNTP，是一種有序的識別過程。 2

27、、 3，→5，外切活性的校正閱讀 E. coli. DNA pol.Ⅰ和pol.Ⅲ有3，→5，外切活性，可刪除錯(cuò)誤插入的核苷酸。 缺失3， →5，外切活性的E. coli. DNA pol.Ⅰ，催化DNA合成時(shí)，出現(xiàn)錯(cuò)誤的幾率增高5-50倍。因此，3，→5，外切活性可以使DNA復(fù)制的真實(shí)性，提高1-2個(gè)數(shù)量級。 圖 3、 影響DNA合成真實(shí)性的因素 ⑴高濃度NMP(如3，-AMP, 5，-GMP) NMP競爭酶的dNTP結(jié)合位點(diǎn)，抑制3，→5，外切活性。 ⑵某一種dNTP濃度銀高,可使引物3，末端離開外切活性中心。 ⑶dNTP 一般與二

28、價(jià)陽離子結(jié)合成活化形式，Mg2+為主要的二價(jià)陽離子。當(dāng)用其它二價(jià)陽離子（如Mn2+）代替Mg2+時(shí)，會改變酶的主體結(jié)構(gòu)，影響聚合活性和3，→3，外切活性。 4、 為什么用RNA引物 ⑴從模板復(fù)制最初幾個(gè)核酸時(shí)，堿基堆集力和氫鍵都較弱，易發(fā)生錯(cuò)配 ⑵新復(fù)制的最初幾個(gè)核苷酸，沒有與模板形成穩(wěn)定雙鏈，DNA聚合酶的5，→3，校對功能難發(fā)揮作用。 第二節(jié) DNA的損傷及修復(fù) DNA的損傷，《羅紀(jì)盛》P428 一些物理化學(xué)因子如紫外線、電離輻射和化學(xué)誘變劑均可引起DNA損傷，破壞其結(jié)構(gòu)與功能。然而在一定條件下，生物機(jī)體能使這種損傷得到修復(fù)。 紫外線可使DNA分子中同一條鏈上兩個(gè)相鄰的胸

29、腺嘧啶堿基之間形成二聚體（TT），兩個(gè)T以共價(jià)鍵形成環(huán)丁烷結(jié)構(gòu)。CT、CC間也可形成少量二聚體（CT、CC），使復(fù)制、轉(zhuǎn)錄受阻。 P346圖19-22 細(xì)胞內(nèi)具有一系列起修復(fù)作用的酶系統(tǒng)，可以除去DNA上的損傷，恢復(fù)DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)。目前已知有4種酶修復(fù)系統(tǒng)：光復(fù)活、切除修復(fù)、重組修復(fù)、SOS反應(yīng)誘導(dǎo)的修復(fù)，后三種不需要光，又稱為暗修復(fù)。 一、 光復(fù)活 1949年已發(fā)現(xiàn)光復(fù)活現(xiàn)象，可見光（最有效400nm）可激活光復(fù)活酶，此酶能分解由于紫外線形成的嘧啶二聚體。高等哺乳動(dòng)物沒有此酶。 P347 圖19-23 紫外線損傷的光復(fù)活過程 A 形成嘧啶二聚體 B. 光復(fù)合酶

30、結(jié)合于損傷部位 C 酶被可見光激活 D. 修復(fù)后釋放酶 二、 切除修復(fù) P348 圖19-24 DNA損傷的切除修復(fù)過程 在一系列酶的作用下，將DNA分子中受損傷部分切除，并以完整的那一條鏈為模板，合成出切去部分，DNA恢復(fù)正常結(jié)構(gòu)。 I、結(jié)構(gòu)缺陷的修復(fù)： （1）核酸內(nèi)切酶識別DNA損傷部位，在其附近將其切開。 （2）核酸外切酶切除損傷的DNA。 （3）DNA聚合酶修復(fù)。 （4）DNA連接酶連接。 圖 II、無嘌呤無嘧啶——堿基缺陷或錯(cuò)配——脫堿基（N-糖苷酶）： 甲基磺酸甲酯可使鳥嘌呤第7位氮原子烷基化，活化β—糖苷鍵，造成脫嘌呤作用；酸也

31、能使DNA脫嘌呤。 DNA復(fù)制時(shí)，DNA聚合酶對dTTP和dUTP分辨力不高，有少量dUTP摻入DNA鏈。細(xì)胞中的尿嘧啶-N-糖苷酶可以切掉尿嘧啶。腺嘌呤脫氨形成次黃嘌呤時(shí)也可以被次黃嘌呤-N-糖苷酶切掉次黃嘌呤。 對于無嘌呤無嘧啶的損傷有兩種修復(fù)方法： （1） AP核酸內(nèi)切酶切開，核酸外切酶切除，DNA聚合酶修復(fù)，DNA連接酶連接。 （2） 插入酶插入正確堿基 三、 重組修復(fù) P349圖19—25重組修復(fù)的過程 切除修復(fù)發(fā)生在DNA復(fù)制之前，而當(dāng)DNA發(fā)動(dòng)復(fù)制時(shí)尚未修復(fù)的損傷部位，可以先復(fù)制，再重組修復(fù)。 在重組修復(fù)過程中，DNA鏈的損傷并未除去。 重組修復(fù)至少需要4種

32、酶組分。 重組基因recA編碼一種分子量為40000的蛋白質(zhì)，它具有交換DNA鏈的活力。RecA蛋白被認(rèn)為在DNA重組和重組修復(fù)中均起關(guān)鍵作用。 recB、recC基因分別編碼核酸外切酶V的兩個(gè)亞基。 此外，修復(fù)合成還需要DNA聚合酶和連接酶。 四、 誘導(dǎo)修復(fù)和應(yīng)急反應(yīng)（SOS反應(yīng)） 誘導(dǎo)修復(fù)是細(xì)胞DNA受到嚴(yán)重?fù)p傷或DNA復(fù)制系統(tǒng)受到抑制的緊急情況下，為求得生存而出現(xiàn)的一系列誘導(dǎo)性修復(fù)。 SOS反應(yīng)誘導(dǎo)的修復(fù)系統(tǒng)包括避免差錯(cuò)的修復(fù)（無差錯(cuò)修復(fù)）和傾向差錯(cuò)的修復(fù)。 避免差錯(cuò)的修復(fù)：SOS反應(yīng)能誘導(dǎo)光復(fù)活切除修復(fù)和重組修復(fù)中某些關(guān)鍵酶和蛋白質(zhì)的產(chǎn)生，從而加強(qiáng)光復(fù)活切除修復(fù)和重組修復(fù)

33、的能力，這屬于避免差錯(cuò)的修復(fù)。 傾向差錯(cuò)的修復(fù)：SOS反應(yīng)還能誘導(dǎo)產(chǎn)生缺乏校對功能的DNA聚合酶，它能在DNA損傷部位進(jìn)行復(fù)制而避免了死亡，可是卻帶來了高的突變率，這屬于傾向差錯(cuò)的修復(fù)。 SOS反應(yīng)是由RecA蛋白和LexA阻遏物相互作用引起的。RecA蛋白不僅在同源重組中起重要作用，而且它也是SOS反應(yīng)的最初發(fā)動(dòng)因子。在有單鏈DNA和ATP存在時(shí)，RecA蛋白被激活而表現(xiàn)出蛋白水解酶的活力，它能分解λ噬菌體的阻遏蛋白和LexA蛋白。LexA蛋白（22Kd）許多基因的阻遏物，當(dāng)它被RecA的蛋白水解酶分解后就可以使一系列基因得到表達(dá)其中包括紫外線損傷的修復(fù)基因uvrA、uvrB、uvrC（

34、分別編碼核酸內(nèi)切酶的亞基）以及recA和lexA基因本身，還有單鏈結(jié)合蛋白基因ssb，與λ噬菌體DNA整合有關(guān)的基因himA、與誘變作用有關(guān)的基因umuDC，與細(xì)胞分裂有關(guān)的基因sulA，ruv，和lon，以及一些功能不清楚的基因dinA，B，D，F(xiàn)等。 SOS反應(yīng)廣泛存在于原核生物和真核生物，它是生物在極為不利的環(huán)境中求得生存的一種基本功能。 然而癌變有可能也是通過SOS反應(yīng)造成的，因?yàn)槟芤餝OS反應(yīng)的作用劑通常都具有致癌作用，如X-射線，紫外線，烷化劑，黃曲霉素等，而某些不能致癌的誘變劑并不引起SOS反應(yīng)，如5-溴尿嘧啶。目前，有關(guān)致癌物的一些簡便檢測方法就是根據(jù)SOS反應(yīng)原理而設(shè)計(jì)

35、的，既測定細(xì)菌的SOS反應(yīng)。 第三節(jié) RNA指導(dǎo)的DNA合成（反轉(zhuǎn)錄） 反轉(zhuǎn)錄（reverse transcription）：以RNA為模板，合成DNA。與通常轉(zhuǎn)錄過程中遺傳信息流從DNA到RNA的方向相反。 1970年，Temin 和Baltimore分別從致癌RNA病毒（勞氏肉瘤病毒和鼠白血病病毒）中發(fā)現(xiàn)發(fā)反轉(zhuǎn)錄酶。 致癌RNA病毒是一大類能引起鳥類、哺乳類等動(dòng)物白血病、肉瘤以及其它腫瘤的病毒。這類病毒侵染細(xì)胞后并不引起細(xì)胞死亡，卻可以使細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。經(jīng)過改造后可以作為基因治療的載體。 放線菌素D（抑制以DNA為模板的反應(yīng)，復(fù)制和轉(zhuǎn)錄）能抑制致癌RNA病毒的復(fù)制，可見致癌R

36、NA病毒的復(fù)制過程必然涉及DNA。 Bader 用嘌呤霉素（puromycin）來抑制靜止細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成，發(fā)現(xiàn)這種細(xì)胞仍能感染勞氏肉瘤病毒（RSV），證實(shí)反轉(zhuǎn)錄酶是由反轉(zhuǎn)錄病毒帶入細(xì)胞的，而不是感染后在宿主細(xì)胞中新合成的。 一、 反轉(zhuǎn)錄酶 由一個(gè)α亞基和一個(gè)β亞基組成，含有Zn2+，具有三種酶活力。 （1）RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活力（以RNA為模板，合成一條互補(bǔ)的DNA，形成RNA—DNA雜種分子）。 （2）RNase H酶活力，水解RNA—DNA雜種分子中的RNA，可沿3’→5’和5’→3’兩個(gè)方向起外切酶作用。 （3）DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活力。 模板：RNA或DNA

37、 以自身病毒類型的RNA為模板時(shí)，該酶的反轉(zhuǎn)錄活力最大，但是帶有適當(dāng)引物的任何種類的RNA都能作為合成DNA的模板。 引物：RNA或DNA 底物：dNTP 二價(jià)陽離子：Mg2+或Mn2+ 真核mRNA3’端有polyA，加入oligo dT后，可以作為反轉(zhuǎn)錄酶的模板，合成cDNA。 二、 病毒RNA的反轉(zhuǎn)錄過程 所有已知的致癌RNA病毒都含有反轉(zhuǎn)錄酶，因此被稱為反轉(zhuǎn)錄病毒（retrovirus），反轉(zhuǎn)錄病毒的復(fù)制需要經(jīng)過一個(gè)DNA中間體（前病毒）。 1、 反轉(zhuǎn)錄病毒的基因組結(jié)構(gòu) P353 圖19-27 （1） 反轉(zhuǎn)錄病毒基因組通常由兩條相同的（+）RNA鏈組成。5’端附近區(qū)

38、域以氫鍵結(jié)合在一起，全長7-10Kb。 （2） 每一條RNA鏈的兩端具有相同的序列，形成正向重復(fù)序列。 （3） 5’端有帽子結(jié)構(gòu)，3’端有polyA，與真核mRNA相似。 （4） 5’端帶有1分子的宿主tRNA，作為反轉(zhuǎn)錄時(shí)的引物。某些鳥類反轉(zhuǎn)錄病毒攜帶的是tRNAtrp，鼠類是tRNApro 2、 反轉(zhuǎn)錄過程。 當(dāng)致癌RNA病毒侵染宿主細(xì)胞時(shí)，病毒RNA及反轉(zhuǎn)錄酶一起進(jìn)入宿主細(xì)胞，病毒自身帶入的反轉(zhuǎn)錄酶使RNA反轉(zhuǎn)錄成雙鏈DNA。 （1） 以病毒（+）RNA為模板，合成互補(bǔ)的（-）DNA。 （2） 切除RNA—DNA雜種分子中的RNA。 （3） 以（-）DNA鏈為模板，合成（

39、+）DNA鏈，最后形成兩端帶有LTR（長末端重復(fù)序列）的雙鏈DNA。 反轉(zhuǎn)錄病毒只有整合到宿主染色體DNA后才能被轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)拼接可以產(chǎn)生不同的病毒mRNA。LTR（長末端重復(fù)序列）對前病毒DNA整合到宿主染色體DNA以及整合后的轉(zhuǎn)錄均起著重要作用。 反轉(zhuǎn)錄病毒合成的過程： 圖 缺口的模板（基因組）RNA，在U3旁生成一個(gè)正鏈DNA的合成RNA的引物，而其余的模板RNA被降解。 正鏈DNA合成開始，復(fù)制。 圖 3、 反轉(zhuǎn)錄病毒的生活周期 P354 圖19-29 （1） 病毒粒子侵染細(xì)胞，病毒RNA和反轉(zhuǎn)錄酶一起進(jìn)入細(xì)胞。 （2） RNA被反轉(zhuǎn)錄成雙

40、鏈DNA（前病毒），環(huán)化，進(jìn)入細(xì)胞核。 （3） 反轉(zhuǎn)錄病毒的DNA整合到宿主染色體DNA中。 （4） 前病毒DNA進(jìn)行復(fù)制，轉(zhuǎn)錄出功能基因、基因組RNA和病毒蛋白。 （5） 基因組RNA和病毒蛋白在胞質(zhì)中組裝成新病毒粒子，轉(zhuǎn)移到質(zhì)膜，通過出芽方式釋放新病毒粒子。 三、 反轉(zhuǎn)錄的生物學(xué)意義。 1．反轉(zhuǎn)錄酶存在于所有致癌RNA病毒中，它的存在與RNA病毒引起細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化有關(guān)。 2．艾滋病毒（AIDS） 人類免疫缺陷病毒（HIV），也是一種反轉(zhuǎn)錄病毒，主要感染T4淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞。病毒粒子直徑100nm，球狀，粒子外包被兩層脂質(zhì)質(zhì)膜，膜上有糖蛋白（gp120、gp41），另有兩層衣

41、殼蛋白p24、p18。 HIV基因組由兩條單鏈正鏈RNA組成，每個(gè)鏈長9.7kb，RNA 5，端有帽子結(jié)構(gòu)，3’端有PolyA，鏈上結(jié)合有反轉(zhuǎn)錄酶。 3．乙肝病毒 大蛋白、中蛋白、主蛋白（表面抗原） 核心抗原 雙鏈環(huán)狀DNA 乙肝病毒與反轉(zhuǎn)錄病毒的區(qū)別： P355 4、真核生物正常細(xì)胞內(nèi)也存在反轉(zhuǎn)錄過程 真核生物的談色體基因組中存在為數(shù)眾多的逆假基因和逆基因。 逆假基因：無啟動(dòng)子和內(nèi)含子，但有polyA的殘基，推測是由mRNA反轉(zhuǎn)錄后整合到基因組中去的。 逆基因：具有啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄功能，無內(nèi)

42、含子?？赡苁怯捎趍RNA反轉(zhuǎn)錄后剛好整合到啟動(dòng)子的下游處，或者是帶啟動(dòng)子的RNA序列反轉(zhuǎn)錄后整合到基因組中 第四節(jié) DNA合成技術(shù) 一、 cDNA合成 1、 cDNA文庫的構(gòu)建 cDNA：以mRNA為模板，用反轉(zhuǎn)錄酶合成第一鏈，去除mRNA，合成的第二鏈。 cDNA文庫是獲得真核結(jié)構(gòu)基因的最好方法，成熟的mRNA無內(nèi)含子。 （1）、 真核mRNA的分離純化 特點(diǎn)：含量少，不均一，表達(dá)具有發(fā)育階段性和組織特異性。 總RNA： rRNA 80~85% mRNA

43、 1~5% tRNA及其它小分子RNA 10~15% 不均一：在1~5%的mRNA中，有10000—30000種mRNA。 分離、純化： 用Oligo dT纖維素柱（親和層析法），加入總RNA，高鹽洗脫，先流出非mRNA，降低鹽濃度，加入Oligo dA競爭，可洗出mRNA 混合物。 免疫法可分離特定的mRNA。 （2）、 cDNA合成（反轉(zhuǎn)錄酶） A. 自身引物法（S1核酸酶降解法） 圖 Oligo(dT)15-18個(gè)核苷酸 mRNA5’端序列有丟失。 B. 取代合成法（較常用） 圖 Oliyo（dT）與

44、mRNA3’端AAA雜交作為引物，合成第一條DNA鏈。 RNaseH在mRNA上產(chǎn)生多個(gè)切口。 DNA pol.Ⅰ切口平移，DNA ligase連接，合成出第二條DNA鏈。 T4DNA pol.切去端頭的RNA-DNA雜交鏈。 C. 引物合成法 可以合成全長cDNA，mRNA的5’端不丟失。 圖 （3）、 cDNA與載體連接 （4）、 重組體的轉(zhuǎn)化 （5）、 擴(kuò)增、保存 2、 獲取特定mRNA的cDNA （1）免疫法分離特定的mRNA （2）PCR法 二、 PCR技術(shù)（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)） Polymerase chain Reaction 以目的基因或D

45、NA片段為模板，在引物介導(dǎo)及Taq DNA聚合酶催化下，在體外用核苷酸大量合成目的基因或DNA片段。 它能快速、專一地?cái)U(kuò)增所希望得到的目的基因或DNA片段。 1、 反應(yīng)物 （1）模板 單、雙鏈DNA或cDNA都可以作為PCR的模板，若以RNA為起始材料，則須經(jīng)反轉(zhuǎn)錄，獲得第一條cDNA后才能用于PCR。 （2）Taq DNA聚合酶 DNA聚合酶是進(jìn)行PCR擴(kuò)增的關(guān)鍵，從水生棲熱菌（Thermus aquaticns VT-1）分離出來。 Taq DNA聚合酶有很好的熱穩(wěn)定性，92.5℃處理130min，仍保留50%的酶活性，在74℃活性最高，錯(cuò)誤摻入核苷酸的比率為1/7500。 （3）引物 引物是決定PCR結(jié)果的關(guān)鍵，它由寡核苷酸組成，15-30個(gè)b （4）核苷酸dNTP dNTP的濃度50-200umul/L。 （5）鎂離子Mg2+ 2、 PCR原理 圖 變性 95℃ 復(fù)性 55℃ 延伸 72℃ １４