生物化學總結：第十三章DNA的復制和修復

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1、第十三章 DNA的復制和修復 生物體的遺傳信息儲存在DNA中，并通過DNA的復制由親代傳給子代。在子代的生長發(fā)育中遺傳信息自DNA轉錄給RNA，然后翻譯成蛋白質以執(zhí)行各種生命功能，使后代表現出與親代相似的遺傳性狀。 1958年，F.Crick提出中心法則： （1）以原DNA分子為模板，合成出相同DNA分子的過程。 （2）以某一段DNA分子為模板，合成出與其序列對應的RNA分子的過程。 （3）以mRNA為模板，根據三聯密碼規(guī)則，合成對應蛋白質的過程。 中心法則揭示了生物體內遺傳信息的傳遞方向。 圖 DNA生物合成有兩種方式：DNA復制和反轉錄 DNA體內復制涉及

2、：原核、真核生物的染色體、細菌質粒（環(huán)狀，雙鏈）、真核細胞器DNA（線粒體、葉綠體）、病毒（雙鏈，環(huán)狀） DNA的體外復制：分子克隆。 第一節(jié) DNA的復制 一、 DNA半保留復制 1953年，Watson和Crick在提出DNA雙螺旋結構模型時就推測DNA可能按照半保留機制進行自我復制。 P321 圖191 Watson和Crick提出的DNA雙螺旋復制模型 在復制過程中，首先親代雙鏈解開，然后每條鏈作為模板，在其上合成互補的子代鏈，結果新形成的兩個子代DNA與親代DNA分子的堿基順序完全一樣，而且每個子代DNA分子中有一條鏈完全來自親代DNA，另一條是新合成的。 1958

3、年，Meselson和Stahl用15N標記E.coli. DNA，證明了DNA的復制是半保留復制。 P322 圖19-2 DNA的半保留復制。 1963年，Cairns用放射自顯影法，在顯微鏡下首次觀察到完整的正在復制的E. coli. 染色體DNA。 P323 圖 19-3 3H-脫氧胸苷標記E.coli. DNA ，經過將近兩代時間，用溶菌酶消化細胞壁，將E.coli. DNA轉至膜上，干燥，壓感光膠片，3H放出β粒子，還原銀，在光學顯微鏡下觀察。用這種方法證明了大腸桿菌染色體DNA是一個環(huán)狀分子，并以半保留的形式進行復制。 DNA的半保留復制可以說明DNA在代謝

4、上的穩(wěn)定性。經過多代復制，DNA的多核苷酸鏈仍可以保持完整，并存在于后代而不被分解掉。 二、 復制起點、單位和方向 DNA的復制是在起始階段進行控制的，一旦復制起始，它就會繼續(xù)下去直到整個復制子完成復制。 1、 復制起點 復制起點是以一條鏈為模板起始DNA合成的一段序列。有時，兩條鏈的復制起點并不總是在同一點上（如D環(huán)復制）。 在一個完整的細胞周期中，每一個復制起點只使用一次，完成一次復制過程。 多數生物的復制起點，都是DNA呼吸作用強烈（甲醛變性實驗）的區(qū)段，即經常開放的區(qū)段，富含A.T。 ★環(huán)狀DNA復制起點的確定方法 P325 圖19-6 ★復制起點的克隆和功能分析

5、——重組質粒轉化法 大腸桿菌的復制起點oriC區(qū)1Kb的重組質粒在轉化子中的復制行為與其染色體一樣，受到嚴密控制，每個細胞只有1-2個拷貝，用核酸外切酶縮短oriC克隆片段的大小，最后得到245bp的基本功能區(qū)，攜帶它的質粒依然能夠自我復制，拷貝數可以增加到20以上，這說明發(fā)動復制的序列在245bp的基本功能區(qū)，而決定拷貝數的序列在基本功能區(qū)之外和1Kb之間。 鼠傷寒沙門氏菌的起點位于一段296bp的DNA片段上，與大腸桿菌的復制起始區(qū)有86%同源性，而且有些親緣關系較遠的細菌，其復制起點在大腸桿菌中亦能起作用。因此，復制起始區(qū)的結構可能是很保守的。 起始序列含有一系列對稱的反向重復和某

6、些短的成簇的保守序列。 2、 復制單位 復制子(Replicon)：Genome能獨立進行復制的單位，每個復制子都含有一個復制起點。 原核生物的染色體和質粒、真核生物的細胞器DNA都是環(huán)狀雙鏈分子，它們都是單復制子，都在一個固定的起點開始復制，復制方向大多數是雙向的，少數是單向復制。多數是對稱復制，少數是不對稱復制（一條鏈復制后才進行另一條鏈的復制）。 環(huán)狀DNA的復制眼象θ，稱θ形復制。 真核生物的染色體DNA是線形雙鏈分子，含有許多復制起點，因此是多復制子，每個復制子約有100-200Kbp。人體細胞平均每個染色體含有1000個復制子。 病毒DNA多種多樣，環(huán)狀或線形，雙鏈或單

7、鏈，但都是單復制子。 3、 復制方向 定點起始，復制方向大多數是雙向的（等速進行或異速進行），形成兩個復制叉，少數是單向復制，形成一個復制叉。 ★用放射自顯影實驗判斷DNA的復制方向及速度 低放射性3H-脫氧胸苷 高放射性3H-脫氧胸苷 a. 單向 b. 雙向等速 三種結果圖形 c. 雙向異速 E.coli.的一個溫度敏感株，在42℃時，能使DNA在完成復制后，不再開始新的復制過程，而在25℃時復制功又能能恢復。 4、 DNA的幾種復制方式 （1）、 直線雙向復制 單點，雙向，T7 多點，雙向，真核染色體DNA （2）、 θ型復制：環(huán)狀雙鏈DNA，單向

8、或雙向（E .coli.） （3）、 滾環(huán)復制：環(huán)狀單鏈DNA，Φx174 （4）、 D環(huán)復制：線粒體、葉綠體DNA （5）、 多復制叉復制： 第一輪復制尚未完成，復制起點就開始第二輪的復制。 在E.coli.富營養(yǎng)時，可采取多復制叉復制方式。E.coli. DNA的復制最快可達50Kb/min，完全復制需40min，富營養(yǎng)時，20min分裂。而真核染色體要6-8小時。 三、 與DNA復制有關的酶及蛋白質因子 目前已發(fā)現30多種酶及蛋白質因子參與DNA復制 （一） DNA的聚合反應和聚合酶 DNA生物合成5，→3，，化學合成3，→5， 1、 DNA聚合反應必備的條件 ⑴

9、DNA聚合酶 ⑵ DNA模板(反轉錄時用RNA模板) ⑶引物 (DNA、RNA或蛋白質) ⑷ 4種dNTP ⑸ Mg2+ 2、 聚合反應過程及特點 總反應式： n1dATP DNA pol . dAMP n2dGTP +DNA dGMP DNA+（n1+n2+n3+n4）PPi n3dCTP Mg2+ dCMP n4dTTP dTMP P329 圖19-10 P330圖1

10、9-11 在鏈的延長過程中，鏈的游離3，-羥基，對進入的脫氧核糖核苷三磷酸α磷原子發(fā)生親核攻擊，生成3，.5，-磷酸二酯鍵，并脫下焦磷酸。 DNA聚合酶的反應特點： ⑴ 以4種dNTP為底物 ⑵ 反應需要接受模板的指導，不能催化游離的dNTP的聚合。 ⑶ 反應需有引物3，-羥基存在 ⑷ 鏈生長方向5， → 3， ⑸ 產物DNA的性質與模板相同 3、 由DNA聚合酶催化的幾種DNA聚合類型 P331圖19-12 （1） 發(fā)莢環(huán)結構：加入單鏈DNA作為模板和引物，3＇羥基端回折成引物鏈。 （2） 末端延伸聚合：加入雙鏈DNA作為模板和引物，3’末

11、端突出作為模板。 （3） 分枝型和切口平移型聚合：加入雙鏈DNA，聚合發(fā)生在切口或末端單鏈區(qū)。 （4） 環(huán)形聚合：加入帶引物的環(huán)形DNA作為模板。 4、 E.coli DNA聚合酶 （1）、 E.coli. DNA pol.I（Kornberg酶，400 copy/cell） 單體酶，分子量109Kd，含一個Zn2+，每個細胞中含400個DNA pol.Ⅰ 催化活性： 5， → 3， 聚合活性 3， → 5， 外切活性 5， → 3， 外切活性 用蛋白水解酶將DNA pol.Ⅰ部分水解可得： 大片段（Klenow），75Kd，活性：5， → 3，聚合活性、3， → 5，

12、外切活性。 小片段，36Kd，活性：5， → 3，外切活性（只作用于雙鏈DNA的堿基配對部分，切除修復）。 Klenow片段的用途： a 補齊DNA 3，隱縮未端 b. 標記DNA片段未端 c．cDNA合成第二鏈 d．d DNA測序 （2）、 E.coli. DNA Pol.Ⅱ（100 copy/cell） 單體酶，分子量120Kd 催化活性：5，→ 3，聚合(活性很低) 3，→ 5，外切 可能在DNA的修復中起某中作用。 （3）、 E.coli.DNA pol.Ⅲ（復制酶，10-20 copy/cell） 寡聚酶，全酶由10種共22個亞基組

13、成，α、ε和θ三種亞基組成核心酶。 P334表10-3 DNA pol.Ⅲ是合成新鏈DNA主要的酶，又稱復制酶(Replicase) Pol.Ⅲ的5，→3，外切酶活性只作用于單鏈DNA。 P334 表19-2 E.coli三種DNA聚合酶的性質比較 ★DNA聚合酶有6個結合位點 ⑴ 模板DNA結合位點 ⑵ 引物結合位點 ⑶ 引物3，-OH位點、反應位點 ⑷ 底物dNTP結合位點 ⑸ 5， → 3， 外切位點(pol.Ⅱ沒有) ⑹ 3， → 5， 外切位點(校正) 5、 真核生物DNA聚合酶

14、 P334 表19-4 真核生物DNA聚合酶 真核DNA聚合酶一般不具備外切活力，可能由另外的酶在DNA復制中起校正功能。 ⑴ DNA聚合酶α，多亞基，功能與E.coli. pol.Ⅲ類似，是真核DNA復制酶。 ⑵ DNA聚合酶β，主要在DNA損傷的修復中起作用。 ⑶ DNA聚合酶γ，從線粒體得到，可能與線粒體DNA的復制有關。 ⑷ DNA聚合酶δ，特點：有3， → 5，外切活力。 （二） 引物酶或RNA聚合酶（引發(fā)酶） 細胞內，DNA的復制需要引物（DNA或RNA），引物酶或RNA聚合酶可合成6-10個堿基的RNA引物。 ★DNA復制為什么要用

15、RNA引物？（為什么DNA聚合酶要用引物，RNA聚合酶不需要引物？） P338 ⑴從模板復制最初幾個核酸時，堿基堆集力和氫鍵都較弱，易發(fā)生錯配 ⑵新復制的最初幾個核苷酸，沒有與模板形成穩(wěn)定雙鏈，DNA聚合酶的5，→3，校對功能難發(fā)揮作用。 （三） 解螺旋酶 大腸桿菌的解螺旋酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ與rep蛋白共同作用，將DNA兩條鏈解開。 解螺旋酶I、II、III沿著模板鏈的5’→3’方向隨著復制叉的前進而移動，而rep蛋白則在另一條模板鏈上沿3’→5’方向移動。 （四） DNA旋轉酶 屬DNA拓撲異構酶Ⅱ，可引入負超螺旋，消除復制叉前進時帶來的扭曲張力。 拓撲異構酶分兩類：I和II，廣

16、泛存在于原核生物和真核生物。 拓撲異構酶I使DNA的一條鏈發(fā)生斷裂和再連接，反應無須供給能量，主要集中在活性轉錄區(qū)，與轉錄有關。 拓撲異構酶Ⅱ使DNA的兩條鏈同時斷裂和再連接，當它引入超螺旋時需要由ATP供給能量。分布在染色質骨架蛋白和核基質部，與復制有關。 （五） 單鏈DNA結合蛋白（SSB） 復制叉上的解螺旋酶，沿雙鏈DNA前進，產生單鏈區(qū)，大量的單鏈DNA結合蛋白與單鏈區(qū)結合，阻止復性和保護單鏈DNA不被核酸酶降解。 （六） DNA連接酶（ligase） 連接雙鏈DNA上的切口。 大腸桿菌連接酶只能在模板上連接DNA缺口。T4DNA ligase即可連接粘性末端的DNA，又

17、可連接平齊末端的雙鏈DNA。 E.coli.和其它細菌的DNA ligase以NAD為能源，動物細胞和噬菌體DNA ligase以ATP為能源。 （七） DNA復制的拓撲結構 P338-339 四、 DNA的半不連續(xù)復制 P336 圖19-15 DNA的半不連續(xù)復制 DNA聚合酶催化的方向是5，→3，。 前導鏈： 滯后鏈： 1968年，發(fā)現岡崎片段。長度： 細菌：1Kb-2Kb，相當于一個順反子的大小。 真核：100-200bp，約等于一個核小體DNA的長度。 五、 DNA復制過程（E.coli.） P342 圖19-17 大腸桿菌的復制體結構示意圖

18、 1、 復制的起始 引發(fā)：當DNA的雙螺旋解開后，合成RNA引物的過程。 引發(fā)體：引物合成酶與各種蛋白質因子（dnaB、dnaC、n、n＇n＇＇I）構成的復合體，負責RNA引物的合成。 引發(fā)體沿著模板鏈5’→3’方向移動（與岡崎片段合成的方向正好相反，而與復制叉移動的方向相同），移到一定位置上即可引發(fā)RNA引物的合成。 E.coli.DNA復制原點ori C，由245bp組成，三組13bp重復序列（近5，端處），四組9 bp重復序列（另一端處）。 圖 大腸桿菌復制原點起始復制所需蛋白質： DNaA 在原點處打開雙螺旋 DNaB

19、 使DNA解旋 DNaC DNaB結合在原點所需 Hu 刺激起始 引物酶（DNaG） 合成RNA引物 SSB 結合單鏈DNA RNA聚合酶 促進DNaA活性 旋轉酶 松馳DNA扭曲應力 20個DnaA結合在四組9bp重復區(qū)，形成起始復合物，DNA環(huán)繞此復合物。 三組13bp重復區(qū)依次變性，產生開放型復合物。 DnaB（在DnaC協助下）與開放復合物結合，進一步解鏈。 2、 DNA鏈的延長反應

20、前導鏈只需要一個RNA引物，后隨鏈的每一個岡崎片段都需要一個RNA引物，鏈的延長反應由DNA pol.Ⅲ催化。 復制體：在DNA合成的生長點（既復制叉上）分布著許多與復制有關的酶和輔助因子，它們在DNA的模板鏈形成離散的復合物，彼此配合進行高度精確的復制，稱為復制體。 復制體沿著復制叉方向前進就合成DNA。 3、 RNA引物的切除及缺口補齊 DNA polⅠ的5， → 3，外切活力，切除RNA引物。 DNApolⅠ的5， → 3，合成活性補齊缺口。 4、 DNA切口的連接 DNA ligase，動物、真核由ATP供能，原核由NAD供能。 5、 DNA合成的終止 環(huán)狀DNA、線

21、性DNA，復制叉相遇即終止。 u 小結： ⑴ DNA解螺旋酶解開雙鏈DNA。 ⑵ SSB結合于DNA單鏈。 ⑶ DNA旋轉酶引入負超螺旋，消除復制叉前進時帶來的扭曲張力。 ⑷ DNA引物酶(在引發(fā)體中)合成RNA引物。 ⑸ DNA pol.Ⅲ在兩條新生鏈上合成DNA。 ⑹ DNA polⅠ切除RNA引物，并補上DNA。 ⑺ DNA ligase連接一個岡崎片段。 DNA復制過程中，聚合酶對dTTP和dUTP的分辨能力高,有少量dUTP摻入DNA鏈中，此時，U-糖苷酶、AP內切酶、DNA polⅠ、DNA ligase共同作用，切除尿嘧啶，接上正確的堿基。 六、 真核生物

22、DNA的復制 P343 1、 復制起點和單位 真核生物染色體DNA是多復制子，有多個復制起點，可以多點起始，分段進行復制。每個復制子大多在100-200bp之間，比細菌染色體DNA（單復制子）小得多。 ★試驗證據：5-氟脫氧胞苷標記 真核生物DNA復制叉移動的速度此原核的慢，如哺乳動物復制叉移動的速度每分鐘1-3Kb，細菌每分鐘5Kb。 真核生物染色體全部復制完成前，起點不再從新開始復制。而在快速生長的原核生物中，起點可以連續(xù)發(fā)動復制。真核生物在快速生長時，可采用更多的復制起點同時復制。如黑腹果蠅，早期胚胎細胞中相鄰復制起點的平均距離為7.9kb，而在培養(yǎng)的成體細胞中，

23、平均距離為40kb，成體細胞只利用一部分復制起點。 2、 復制過程中組蛋白的裝配 核小體的結構（200bp左右） 在真核生物的復制子上，親代染色體的核小體被逐個打開，組蛋白以完整的八聚體形式直接轉移到子代DNA的前導鏈上，新合成的組蛋白與后隨鏈組裝成核小體。因此，DNA的復制是半保留的，而組蛋白則是全保留的。 ★試驗證據：環(huán)己酮亞胺抑制組蛋白合成，電子顯微鏡下觀察 3、 真核生物DNA復制的終止 端粒：一段DNA序列與蛋白質形成的一種復合體，是真核細胞染色體末端所特有的結構。 功能： ⑴保證線性DNA的完整復制 ⑵保護染色體末端 ⑶決定細胞壽命，胚系細胞含端粒酶，體細胞不表

24、達端粒酶。 端粒（telomeres）分布于線性真核染色體未端。酵母端粒約100bp的重復序列，形式為：5，（TxGy）n3，(AxCy) n，x和y一般為1—4。 端粒末端的重復序列，通過端粒酶（telomerase）將其加到染色體末端。 端粒酶含有RNA和蛋白質（起DNA聚合酶的作用）兩種組分，RNA分子約159b，含有多個CyAx重復序列，RNA分子用作端粒TxGy鏈合成的模板。端粒酶是一種反轉錄酶，它只合成與酶自身的RNA模板互補的DNA片段。 人類體細胞的端粒長度，隨個體年齡增加而逐漸縮短。細胞每分裂一次，端?？s短50-200bp，短至1-4Kbp時，細胞就停止分裂。若能重建

25、端粒，則細胞可以永遠分裂。惡性腫瘤細胞端酶表達多。 ⑴雜交 圖 ⑵聚合 圖 ⑶轉位再雜交 圖 ⑷進一步聚合 圖 ⑸非標準GG配對 圖 七、 DNA復制的調控 八、 DNA復制的真實性 《楊岐生》P144 生物體DNA復制具有高度真實性，復制107-1011堿基對,只有一個錯誤堿基。 堿基對的自由能通常在4-13KJ/mol，這樣的自由能相當于平均參入100個核苷酸就可能出現一次錯配，僅靠Watson-Crick雙螺旋的堿基配對原則，突變率將高達10-2 。 1、 DNA聚合酶對堿基的選擇作

26、用 酶的被動論：不同的核苷酸在聚合位點停留時間不同，正確的dNTP能長時間停留，而參與聚合。DNA聚合酶能依照模板的核苷酸，選擇正確的dNTP摻入引物末端。 酶積極參與理論：DNA聚合酶對正確與錯誤的核苷酸，不僅親和性不同，而且將它們插入DNA引物端的速度也不同。 動力學校正閱讀：在新的磷酸二酯鍵未形成時，dNTP結合在酶與模板—引物復合物的聚合位點上，DNA聚合酶能識別正確與錯誤的dNTP。 DNA聚合酶對底物的識別作用，DNA聚合酶有兩種底物，一種是DNA模板—引物，另一種是dNTP。 DNA聚合酶先識別DNA模板和引物的3，未端，再識別底物dNTP，是一種有序的識別過程。 2

27、、 3，→5，外切活性的校正閱讀 E. coli. DNA pol.Ⅰ和pol.Ⅲ有3，→5，外切活性，可刪除錯誤插入的核苷酸。 缺失3， →5，外切活性的E. coli. DNA pol.Ⅰ，催化DNA合成時，出現錯誤的幾率增高5-50倍。因此，3，→5，外切活性可以使DNA復制的真實性，提高1-2個數量級。 圖 3、 影響DNA合成真實性的因素 ⑴高濃度NMP(如3，-AMP, 5，-GMP) NMP競爭酶的dNTP結合位點，抑制3，→5，外切活性。 ⑵某一種dNTP濃度銀高,可使引物3，末端離開外切活性中心。 ⑶dNTP 一般與二

28、價陽離子結合成活化形式，Mg2+為主要的二價陽離子。當用其它二價陽離子（如Mn2+）代替Mg2+時，會改變酶的主體結構，影響聚合活性和3，→3，外切活性。 4、 為什么用RNA引物 ⑴從模板復制最初幾個核酸時，堿基堆集力和氫鍵都較弱，易發(fā)生錯配 ⑵新復制的最初幾個核苷酸，沒有與模板形成穩(wěn)定雙鏈，DNA聚合酶的5，→3，校對功能難發(fā)揮作用。 第二節(jié) DNA的損傷及修復 DNA的損傷，《羅紀盛》P428 一些物理化學因子如紫外線、電離輻射和化學誘變劑均可引起DNA損傷，破壞其結構與功能。然而在一定條件下，生物機體能使這種損傷得到修復。 紫外線可使DNA分子中同一條鏈上兩個相鄰的胸

29、腺嘧啶堿基之間形成二聚體（TT），兩個T以共價鍵形成環(huán)丁烷結構。CT、CC間也可形成少量二聚體（CT、CC），使復制、轉錄受阻。 P346圖19-22 細胞內具有一系列起修復作用的酶系統(tǒng)，可以除去DNA上的損傷，恢復DNA的雙螺旋結構。目前已知有4種酶修復系統(tǒng)：光復活、切除修復、重組修復、SOS反應誘導的修復，后三種不需要光，又稱為暗修復。 一、 光復活 1949年已發(fā)現光復活現象，可見光（最有效400nm）可激活光復活酶，此酶能分解由于紫外線形成的嘧啶二聚體。高等哺乳動物沒有此酶。 P347 圖19-23 紫外線損傷的光復活過程 A 形成嘧啶二聚體 B. 光復合酶

30、結合于損傷部位 C 酶被可見光激活 D. 修復后釋放酶 二、 切除修復 P348 圖19-24 DNA損傷的切除修復過程 在一系列酶的作用下，將DNA分子中受損傷部分切除，并以完整的那一條鏈為模板，合成出切去部分，DNA恢復正常結構。 I、結構缺陷的修復： （1）核酸內切酶識別DNA損傷部位，在其附近將其切開。 （2）核酸外切酶切除損傷的DNA。 （3）DNA聚合酶修復。 （4）DNA連接酶連接。 圖 II、無嘌呤無嘧啶——堿基缺陷或錯配——脫堿基（N-糖苷酶）： 甲基磺酸甲酯可使鳥嘌呤第7位氮原子烷基化，活化β—糖苷鍵，造成脫嘌呤作用；酸也

31、能使DNA脫嘌呤。 DNA復制時，DNA聚合酶對dTTP和dUTP分辨力不高，有少量dUTP摻入DNA鏈。細胞中的尿嘧啶-N-糖苷酶可以切掉尿嘧啶。腺嘌呤脫氨形成次黃嘌呤時也可以被次黃嘌呤-N-糖苷酶切掉次黃嘌呤。 對于無嘌呤無嘧啶的損傷有兩種修復方法： （1） AP核酸內切酶切開，核酸外切酶切除，DNA聚合酶修復，DNA連接酶連接。 （2） 插入酶插入正確堿基 三、 重組修復 P349圖19—25重組修復的過程 切除修復發(fā)生在DNA復制之前，而當DNA發(fā)動復制時尚未修復的損傷部位，可以先復制，再重組修復。 在重組修復過程中，DNA鏈的損傷并未除去。 重組修復至少需要4種

32、酶組分。 重組基因recA編碼一種分子量為40000的蛋白質，它具有交換DNA鏈的活力。RecA蛋白被認為在DNA重組和重組修復中均起關鍵作用。 recB、recC基因分別編碼核酸外切酶V的兩個亞基。 此外，修復合成還需要DNA聚合酶和連接酶。 四、 誘導修復和應急反應（SOS反應） 誘導修復是細胞DNA受到嚴重損傷或DNA復制系統(tǒng)受到抑制的緊急情況下，為求得生存而出現的一系列誘導性修復。 SOS反應誘導的修復系統(tǒng)包括避免差錯的修復（無差錯修復）和傾向差錯的修復。 避免差錯的修復：SOS反應能誘導光復活切除修復和重組修復中某些關鍵酶和蛋白質的產生，從而加強光復活切除修復和重組修復

33、的能力，這屬于避免差錯的修復。 傾向差錯的修復：SOS反應還能誘導產生缺乏校對功能的DNA聚合酶，它能在DNA損傷部位進行復制而避免了死亡，可是卻帶來了高的突變率，這屬于傾向差錯的修復。 SOS反應是由RecA蛋白和LexA阻遏物相互作用引起的。RecA蛋白不僅在同源重組中起重要作用，而且它也是SOS反應的最初發(fā)動因子。在有單鏈DNA和ATP存在時，RecA蛋白被激活而表現出蛋白水解酶的活力，它能分解λ噬菌體的阻遏蛋白和LexA蛋白。LexA蛋白（22Kd）許多基因的阻遏物，當它被RecA的蛋白水解酶分解后就可以使一系列基因得到表達其中包括紫外線損傷的修復基因uvrA、uvrB、uvrC（

34、分別編碼核酸內切酶的亞基）以及recA和lexA基因本身，還有單鏈結合蛋白基因ssb，與λ噬菌體DNA整合有關的基因himA、與誘變作用有關的基因umuDC，與細胞分裂有關的基因sulA，ruv，和lon，以及一些功能不清楚的基因dinA，B，D，F等。 SOS反應廣泛存在于原核生物和真核生物，它是生物在極為不利的環(huán)境中求得生存的一種基本功能。 然而癌變有可能也是通過SOS反應造成的，因為能引起SOS反應的作用劑通常都具有致癌作用，如X-射線，紫外線，烷化劑，黃曲霉素等，而某些不能致癌的誘變劑并不引起SOS反應，如5-溴尿嘧啶。目前，有關致癌物的一些簡便檢測方法就是根據SOS反應原理而設計

35、的，既測定細菌的SOS反應。 第三節(jié) RNA指導的DNA合成（反轉錄） 反轉錄（reverse transcription）：以RNA為模板，合成DNA。與通常轉錄過程中遺傳信息流從DNA到RNA的方向相反。 1970年，Temin 和Baltimore分別從致癌RNA病毒（勞氏肉瘤病毒和鼠白血病病毒）中發(fā)現發(fā)反轉錄酶。 致癌RNA病毒是一大類能引起鳥類、哺乳類等動物白血病、肉瘤以及其它腫瘤的病毒。這類病毒侵染細胞后并不引起細胞死亡，卻可以使細胞發(fā)生惡性轉化。經過改造后可以作為基因治療的載體。 放線菌素D（抑制以DNA為模板的反應，復制和轉錄）能抑制致癌RNA病毒的復制，可見致癌R

36、NA病毒的復制過程必然涉及DNA。 Bader 用嘌呤霉素（puromycin）來抑制靜止細胞蛋白質的合成，發(fā)現這種細胞仍能感染勞氏肉瘤病毒（RSV），證實反轉錄酶是由反轉錄病毒帶入細胞的，而不是感染后在宿主細胞中新合成的。 一、 反轉錄酶 由一個α亞基和一個β亞基組成，含有Zn2+，具有三種酶活力。 （1）RNA指導的DNA聚合酶活力（以RNA為模板，合成一條互補的DNA，形成RNA—DNA雜種分子）。 （2）RNase H酶活力，水解RNA—DNA雜種分子中的RNA，可沿3’→5’和5’→3’兩個方向起外切酶作用。 （3）DNA指導的DNA聚合酶活力。 模板：RNA或DNA

37、 以自身病毒類型的RNA為模板時，該酶的反轉錄活力最大，但是帶有適當引物的任何種類的RNA都能作為合成DNA的模板。 引物：RNA或DNA 底物：dNTP 二價陽離子：Mg2+或Mn2+ 真核mRNA3’端有polyA，加入oligo dT后，可以作為反轉錄酶的模板，合成cDNA。 二、 病毒RNA的反轉錄過程 所有已知的致癌RNA病毒都含有反轉錄酶，因此被稱為反轉錄病毒（retrovirus），反轉錄病毒的復制需要經過一個DNA中間體（前病毒）。 1、 反轉錄病毒的基因組結構 P353 圖19-27 （1） 反轉錄病毒基因組通常由兩條相同的（+）RNA鏈組成。5’端附近區(qū)

38、域以氫鍵結合在一起，全長7-10Kb。 （2） 每一條RNA鏈的兩端具有相同的序列，形成正向重復序列。 （3） 5’端有帽子結構，3’端有polyA，與真核mRNA相似。 （4） 5’端帶有1分子的宿主tRNA，作為反轉錄時的引物。某些鳥類反轉錄病毒攜帶的是tRNAtrp，鼠類是tRNApro 2、 反轉錄過程。 當致癌RNA病毒侵染宿主細胞時，病毒RNA及反轉錄酶一起進入宿主細胞，病毒自身帶入的反轉錄酶使RNA反轉錄成雙鏈DNA。 （1） 以病毒（+）RNA為模板，合成互補的（-）DNA。 （2） 切除RNA—DNA雜種分子中的RNA。 （3） 以（-）DNA鏈為模板，合成（

39、+）DNA鏈，最后形成兩端帶有LTR（長末端重復序列）的雙鏈DNA。 反轉錄病毒只有整合到宿主染色體DNA后才能被轉錄，轉錄產物經拼接可以產生不同的病毒mRNA。LTR（長末端重復序列）對前病毒DNA整合到宿主染色體DNA以及整合后的轉錄均起著重要作用。 反轉錄病毒合成的過程： 圖 缺口的模板（基因組）RNA，在U3旁生成一個正鏈DNA的合成RNA的引物，而其余的模板RNA被降解。 正鏈DNA合成開始，復制。 圖 3、 反轉錄病毒的生活周期 P354 圖19-29 （1） 病毒粒子侵染細胞，病毒RNA和反轉錄酶一起進入細胞。 （2） RNA被反轉錄成雙

40、鏈DNA（前病毒），環(huán)化，進入細胞核。 （3） 反轉錄病毒的DNA整合到宿主染色體DNA中。 （4） 前病毒DNA進行復制，轉錄出功能基因、基因組RNA和病毒蛋白。 （5） 基因組RNA和病毒蛋白在胞質中組裝成新病毒粒子，轉移到質膜，通過出芽方式釋放新病毒粒子。 三、 反轉錄的生物學意義。 1．反轉錄酶存在于所有致癌RNA病毒中，它的存在與RNA病毒引起細胞惡性轉化有關。 2．艾滋病毒（AIDS） 人類免疫缺陷病毒（HIV），也是一種反轉錄病毒，主要感染T4淋巴細胞和B淋巴細胞。病毒粒子直徑100nm，球狀，粒子外包被兩層脂質質膜，膜上有糖蛋白（gp120、gp41），另有兩層衣

41、殼蛋白p24、p18。 HIV基因組由兩條單鏈正鏈RNA組成，每個鏈長9.7kb，RNA 5，端有帽子結構，3’端有PolyA，鏈上結合有反轉錄酶。 3．乙肝病毒 大蛋白、中蛋白、主蛋白（表面抗原） 核心抗原 雙鏈環(huán)狀DNA 乙肝病毒與反轉錄病毒的區(qū)別： P355 4、真核生物正常細胞內也存在反轉錄過程 真核生物的談色體基因組中存在為數眾多的逆假基因和逆基因。 逆假基因：無啟動子和內含子，但有polyA的殘基，推測是由mRNA反轉錄后整合到基因組中去的。 逆基因：具有啟動子和轉錄功能，無內

42、含子?？赡苁怯捎趍RNA反轉錄后剛好整合到啟動子的下游處，或者是帶啟動子的RNA序列反轉錄后整合到基因組中 第四節(jié) DNA合成技術 一、 cDNA合成 1、 cDNA文庫的構建 cDNA：以mRNA為模板，用反轉錄酶合成第一鏈，去除mRNA，合成的第二鏈。 cDNA文庫是獲得真核結構基因的最好方法，成熟的mRNA無內含子。 （1）、 真核mRNA的分離純化 特點：含量少，不均一，表達具有發(fā)育階段性和組織特異性。 總RNA： rRNA 80~85% mRNA

43、 1~5% tRNA及其它小分子RNA 10~15% 不均一：在1~5%的mRNA中，有10000—30000種mRNA。 分離、純化： 用Oligo dT纖維素柱（親和層析法），加入總RNA，高鹽洗脫，先流出非mRNA，降低鹽濃度，加入Oligo dA競爭，可洗出mRNA 混合物。 免疫法可分離特定的mRNA。 （2）、 cDNA合成（反轉錄酶） A. 自身引物法（S1核酸酶降解法） 圖 Oligo(dT)15-18個核苷酸 mRNA5’端序列有丟失。 B. 取代合成法（較常用） 圖 Oliyo（dT）與

44、mRNA3’端AAA雜交作為引物，合成第一條DNA鏈。 RNaseH在mRNA上產生多個切口。 DNA pol.Ⅰ切口平移，DNA ligase連接，合成出第二條DNA鏈。 T4DNA pol.切去端頭的RNA-DNA雜交鏈。 C. 引物合成法 可以合成全長cDNA，mRNA的5’端不丟失。 圖 （3）、 cDNA與載體連接 （4）、 重組體的轉化 （5）、 擴增、保存 2、 獲取特定mRNA的cDNA （1）免疫法分離特定的mRNA （2）PCR法 二、 PCR技術（聚合酶鏈式反應） Polymerase chain Reaction 以目的基因或D

45、NA片段為模板，在引物介導及Taq DNA聚合酶催化下，在體外用核苷酸大量合成目的基因或DNA片段。 它能快速、專一地擴增所希望得到的目的基因或DNA片段。 1、 反應物 （1）模板 單、雙鏈DNA或cDNA都可以作為PCR的模板，若以RNA為起始材料，則須經反轉錄，獲得第一條cDNA后才能用于PCR。 （2）Taq DNA聚合酶 DNA聚合酶是進行PCR擴增的關鍵，從水生棲熱菌（Thermus aquaticns VT-1）分離出來。 Taq DNA聚合酶有很好的熱穩(wěn)定性，92.5℃處理130min，仍保留50%的酶活性，在74℃活性最高，錯誤摻入核苷酸的比率為1/7500。 （3）引物 引物是決定PCR結果的關鍵，它由寡核苷酸組成，15-30個b （4）核苷酸dNTP dNTP的濃度50-200umul/L。 （5）鎂離子Mg2+ 2、 PCR原理 圖 變性 95℃ 復性 55℃ 延伸 72℃ １４