第2章 植物組織培養(yǎng)技術(shù)

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1、第2章 植物組織培養(yǎng)技術(shù)第二節(jié) 植物組織培養(yǎng)概述一、授課章節(jié)第二節(jié) 植物組織培養(yǎng)概述。二、學(xué)時(shí)安排2學(xué)時(shí)。三、教學(xué)目標(biāo)1掌握植物組織培養(yǎng)的含義。2了解植物組織培養(yǎng)的類(lèi)型劃分。3理解植物組織培養(yǎng)的應(yīng)用原理。4掌握植物組織培養(yǎng)的特點(diǎn)和應(yīng)用。四、教學(xué)重點(diǎn)、難點(diǎn)分析重點(diǎn):植物組織培養(yǎng)的含義、特點(diǎn)和應(yīng)用。難點(diǎn):植物組織培養(yǎng)的應(yīng)用原理。五、教具電化教學(xué)設(shè)備,植物組織培養(yǎng)試管苗。六、教學(xué)方法講授法,多媒體課件。七、教學(xué)過(guò)程.導(dǎo)入前面我們學(xué)習(xí)了有關(guān)植物育種的一些知識(shí),今天,請(qǐng)看我給同學(xué)們看一樣?xùn)|西(教師拿出試管苗),問(wèn)同學(xué)們這是什么呢?這就是我們要學(xué)的植物組織培養(yǎng)。II.新課一、植物組織培養(yǎng)的含義植物組織培養(yǎng)

2、是指在無(wú)菌條件下,將離體的植物器官、組織、細(xì)胞以及原生質(zhì)體培養(yǎng)在人工培養(yǎng)基上,給予適宜的培養(yǎng)條件,使其長(zhǎng)成完整植株的過(guò)程。由于培養(yǎng)物脫離母株在試管內(nèi)培養(yǎng),故又稱(chēng)離體培養(yǎng)、試管培養(yǎng)。二、植物組織培養(yǎng)的類(lèi)型植物組織培養(yǎng)由于分類(lèi)依據(jù)不同可劃分為不同的類(lèi)型。植株培養(yǎng):對(duì)幼小植株的培養(yǎng)。植物組織培養(yǎng)根據(jù)培養(yǎng)對(duì)象器官培養(yǎng):對(duì)根、莖、葉、花、果實(shí)、種子等離體器官的培養(yǎng)。組織培養(yǎng):對(duì)植物體的各部分組織進(jìn)行的培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng):對(duì)單個(gè)細(xì)胞或較小細(xì)胞團(tuán)的培養(yǎng)。原生質(zhì)體培養(yǎng):對(duì)除去細(xì)胞壁的原生質(zhì)體的培養(yǎng)。根據(jù)培養(yǎng)方式固體培養(yǎng):加入瓊脂等凝固劑,使培養(yǎng)基固體化,在此培養(yǎng)基上的培養(yǎng)。液體培養(yǎng):培養(yǎng)基中不加凝固劑,培養(yǎng)基為液

3、體,在此培養(yǎng)基上的培養(yǎng)。根據(jù)培養(yǎng)過(guò)程初代培養(yǎng):將外植體進(jìn)行的第一次培養(yǎng)。繼代培養(yǎng):將培養(yǎng)一段時(shí)間的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接到新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)的過(guò)程。光培養(yǎng):培養(yǎng)過(guò)程中需要光照的培養(yǎng)。暗培養(yǎng):培養(yǎng)過(guò)程中不需要光照的培養(yǎng)。根據(jù)培養(yǎng)條件三、植物組織培養(yǎng)的應(yīng)用原理(一)植物細(xì)胞全能性植物細(xì)胞全能性,是指植物體上每個(gè)具有完整細(xì)胞核的植物細(xì)胞,都具有該植物體的全部遺傳信息和產(chǎn)生完整植株的能力。植物的體細(xì)胞一旦脫離所在器官或組織的束縛成為離體狀態(tài)時(shí),在一定的營(yíng)養(yǎng)、激素和外界條件作用下,就可能表現(xiàn)出全能性,而生長(zhǎng)發(fā)育成為完整的植株。(二)細(xì)胞的分化和形態(tài)建成(三)植物的再生功能四、植物組織培養(yǎng)的特點(diǎn)(一)研究材料來(lái)源單一

4、,無(wú)性系遺傳信息相同(二)試驗(yàn)經(jīng)濟(jì),管理方便,工作效率高(三)培養(yǎng)條件人為控制,可周年連續(xù)進(jìn)行試驗(yàn)或生產(chǎn)(四)生長(zhǎng)快,周期短,繁殖率高五、植物組織培養(yǎng)的應(yīng)用(一)優(yōu)良品種的快速繁殖(二)脫毒及脫毒苗的再繁育(三)植物新品種的培育(四)種質(zhì)資源的保存和交換(五)有用次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)III.作業(yè)1.簡(jiǎn)述植物組織培養(yǎng)的概念和培養(yǎng)類(lèi)型。2.植物組織培養(yǎng)技術(shù)有哪些特點(diǎn)?3.植物組織培養(yǎng)在生產(chǎn)上有哪些方面的應(yīng)用? 4.通過(guò)學(xué)習(xí),你對(duì)植物組織培養(yǎng)技術(shù)是怎樣理解的?第二節(jié) 植物組織培養(yǎng)廠房的設(shè)計(jì)與構(gòu)建一、授課章節(jié)第二節(jié) 植物組織培養(yǎng)廠房的設(shè)計(jì)與構(gòu)建。二、學(xué)時(shí)安排2學(xué)時(shí)。三、教學(xué)目標(biāo)1了解組培工廠的基本結(jié)構(gòu)、

5、各部分結(jié)構(gòu)的具體功能。2理解組培工廠的設(shè)計(jì)原則與總體要求,能夠根據(jù)需要和實(shí)際情況科學(xué)設(shè)計(jì)組培工廠。3掌握廠房的基本組成,儀器設(shè)備配備與設(shè)計(jì)要求。4了解常用儀器與用具的使用方法。四、教學(xué)重點(diǎn)、難點(diǎn)分析重點(diǎn):組培工廠的設(shè)計(jì)原則與總體要求。難點(diǎn):根據(jù)需要和實(shí)際情況科學(xué)設(shè)計(jì)組培工廠。五、教具電化教學(xué)設(shè)備、組培工廠現(xiàn)場(chǎng)或?qū)嶒?yàn)室。六、教學(xué)方法講授法,演示法。七、教學(xué)過(guò)程.導(dǎo)入復(fù)習(xí):植物組織培養(yǎng)的概念,類(lèi)型及應(yīng)用。提問(wèn):細(xì)胞全能性的概念。上次課我們學(xué)習(xí)了植物組織培養(yǎng)的基本知識(shí),那么從事植物組織培養(yǎng)的生產(chǎn)需要一些基本的儀器和設(shè)備,今天我們來(lái)學(xué)習(xí)植物組織培養(yǎng)的廠房的設(shè)計(jì)與構(gòu)建。II.新課一、植物組織培養(yǎng)廠房的設(shè)

6、計(jì)(一)設(shè)計(jì)原則1.環(huán)境清潔、安靜、遠(yuǎn)離污染源。2.按照工作的目的和規(guī)模決定廠房的設(shè)計(jì)。3.按照自然工作程序先后合理布局,避免生產(chǎn)環(huán)節(jié)倒排。4.經(jīng)濟(jì)實(shí)用,節(jié)能安全。(二)具體要求1.廠房選址時(shí)應(yīng)選擇周?chē)察o、陽(yáng)光充足、無(wú)高大建筑物遮擋的環(huán)境;最好在常年主風(fēng)向的上風(fēng)方向,盡量減少污染;要求交通便利,便于產(chǎn)品的運(yùn)送。2.廠房各車(chē)間的大小和比例相對(duì)合理,車(chē)間的設(shè)計(jì)和設(shè)備的配置、擺放與其功能相適應(yīng)。3.廠房必須滿(mǎn)足3個(gè)基本的需要:生產(chǎn)準(zhǔn)備(器皿洗滌與存放、培養(yǎng)基制備、各種器具的滅菌)、無(wú)菌操作和控制培養(yǎng)。4.廠房的建筑與裝修材料要耐腐蝕,便于消毒和清潔。(三)廠房基本組成廠房根據(jù)結(jié)構(gòu)和應(yīng)用范圍一般設(shè)計(jì)

7、為藥品配制間、洗滌間、培養(yǎng)基制作間、緩沖間、無(wú)菌操作間、試管苗培養(yǎng)間、試管苗馴化移植間。1.藥品配制間(1)任務(wù):主要用于化學(xué)藥品的儲(chǔ)藏、稱(chēng)量和溶液的配制。(2)設(shè)計(jì)要求:干燥、通風(fēng)、無(wú)直射光線。房間內(nèi)設(shè)立工作臺(tái),工作臺(tái)最好用抗鹽堿,耐腐蝕的臺(tái)面,要牢固、平穩(wěn),具有較好的抗震性能。注意磁力攪拌器與電子天平要分開(kāi)臺(tái)面放置。(3)儀器與用具配置:大型工作臺(tái)、藥品柜、普通冰箱、電子分析天平、托盤(pán)天平、磁力攪拌器、容量瓶、燒杯、量筒等。2.洗滌間(1)任務(wù):洗滌室用于完成玻璃器皿等儀器的清洗、干燥和貯存;外植體的預(yù)處理與清洗;試管苗的出瓶、清洗與整理等工作。(2)設(shè)計(jì)要求:房間內(nèi)應(yīng)寬敞明亮,方便多人同

8、時(shí)操作;配備大型水槽,上下水道要暢通;地面、天花板及墻壁應(yīng)耐濕和便于清潔;應(yīng)有晾干臺(tái),用于放置洗滌后的培養(yǎng)器皿。(3)儀器與用具配置:水槽、晾干臺(tái)、周轉(zhuǎn)箱、烘箱等。3.培養(yǎng)基制作間(1)任務(wù):主要負(fù)責(zé)培養(yǎng)基的配制、分裝、包扎和高壓滅菌等工作。(2)設(shè)計(jì)要求:房間寬敞明亮、通風(fēng)良好,方便多人同時(shí)操作;目前滅菌大多采用電加溫,墻體建筑時(shí)要預(yù)先設(shè)計(jì)電路線,確保用電線路和滅菌鍋的用電安全。在滅菌鍋上方的墻壁設(shè)置換氣窗,利于通風(fēng)排氣。地面、墻壁應(yīng)用耐濕材料鋪設(shè),防水、防潮、防腐蝕。(3)儀器與用具配置:托盤(pán)天平、酸度計(jì)、工作臺(tái)、高壓滅菌鍋、周轉(zhuǎn)箱、儲(chǔ)物柜等。4.緩沖間(1)任務(wù):防止工作人員進(jìn)出時(shí)帶進(jìn)雜

9、菌。(2)設(shè)計(jì)要求:面積一般23m2為宜;緩沖間應(yīng)安裝紫外燈,用以照射滅菌;配備鞋柜、衣柜、拖鞋,用于工作人員進(jìn)入無(wú)菌操作室前在此更衣?lián)Q鞋,(3)儀器與用具配置:紫外燈、鞋柜、衣柜、工作服等。5.無(wú)菌操作間(接種間)(1)任務(wù):進(jìn)行植物材料的分離接種及培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移。(2)設(shè)計(jì)要求:接種室宜小不宜大,一般78m2。地面、天花板及四壁要求盡可能密閉光滑,易于清潔和消毒。配置推拉門(mén),以減少開(kāi)關(guān)門(mén)時(shí)的空氣擾動(dòng)。房間密閉,干爽安靜,清潔明亮。在適當(dāng)位置吊裝12盞紫外燈,用以照射滅菌。最好安裝一小型空調(diào),使室溫可控,這樣可使門(mén)窗緊閉,減少與外界空氣對(duì)流。(3)儀器與用具配置:超凈工作臺(tái)、紫外燈、空調(diào)機(jī)、醫(yī)用

10、小推車(chē)、接種器具消毒器、酒精燈、接種工具、擱物架等。6.試管苗培養(yǎng)間(1)任務(wù):接種材料的培養(yǎng)生長(zhǎng)。(2)設(shè)計(jì)要求:培養(yǎng)間的大小可根據(jù)生產(chǎn)規(guī)模和培養(yǎng)架的大小、數(shù)目及其它附屬設(shè)備而定。其設(shè)計(jì)以充分利用空間和節(jié)省能源為原則。高度比培養(yǎng)架略高為宜,周?chē)鷫Ρ诤吞旎ò逡蠊饣教?、有絕熱防火的性能。能夠控制光照和溫度,并保持相對(duì)的無(wú)菌環(huán)境;適當(dāng)位置安裝紫外燈進(jìn)行照射滅菌。(3)儀器與用具配置:培養(yǎng)架、空調(diào)機(jī)、光照時(shí)控器、溫度計(jì)、搖床等。7.試管苗馴化移植間(1)任務(wù):進(jìn)行試管苗的馴化和移植。(2)設(shè)計(jì)要求:通常在日光溫室內(nèi)進(jìn)行,其面積大小根據(jù)生產(chǎn)規(guī)模而定。要求能夠控溫調(diào)濕、控光通風(fēng)、控菌防蟲(chóng)。(3)儀器

11、與用具配置:移栽容器、彌霧裝置、遮陽(yáng)網(wǎng)、移栽基質(zhì)等。二、基本儀器設(shè)備和用具(一)滅菌設(shè)備1.濕熱滅菌設(shè)備(高壓蒸汽滅菌鍋):用于培養(yǎng)基、玻璃器皿以及其它可高溫滅菌用品的滅菌,根據(jù)規(guī)模大小有小型手提式、中型立式、大型臥式等不同規(guī)格;根據(jù)控制方式分為手動(dòng)控制、半自動(dòng)控制和全自動(dòng)控制等不同類(lèi)型。2.過(guò)濾滅菌設(shè)備(防細(xì)菌濾膜):防細(xì)菌濾膜的網(wǎng)孔直徑為0.45m以下,當(dāng)溶液通過(guò)濾膜后,細(xì)菌的細(xì)胞和真菌的孢子等因大于濾膜直徑而被阻,在需要過(guò)濾滅菌的液體量大時(shí),常使用抽濾裝置;液量小時(shí),可用注射器。主要用于赤霉素、玉米素、脫落酸等不耐熱物質(zhì)的滅菌。3.干熱滅菌設(shè)備:利用高溫烘烤或灼燒的方法進(jìn)行滅菌,包括烘箱

12、(器皿和器械的滅菌)、酒精燈(用于接種工具的滅菌)、接種器械滅菌器等。4.其它滅菌設(shè)備:利用紫外光波、超聲波、臭氧等殺菌,主要用于對(duì)空氣和物體表面進(jìn)行消毒。常用設(shè)備包括紫外燈、超聲波清洗器、臭氧發(fā)生器等。(二)接種設(shè)備與用具1.超凈工作臺(tái):超凈工作臺(tái)是植物組織培養(yǎng)最常用、最普及的無(wú)菌操作裝置。根據(jù)風(fēng)幕形成的方式可分為水平風(fēng)和垂直風(fēng)兩種;根據(jù)使用方式分為單人單面、雙人單面、雙人雙面等。2.接種工具:外植體接種或培養(yǎng)物繼代轉(zhuǎn)接時(shí)使用的各種工具。常用的有:尖頭鑷:用于分離植物組織等;槍型鑷:用于夾取植物器官繼代轉(zhuǎn)接和外植體接種;解剖剪:用于幼嫩組織、細(xì)胞團(tuán)等剪?。粡濐^剪:用于轉(zhuǎn)接、剪取試管苗莖段等;

13、解剖刀:用于外植體或培養(yǎng)物切割;接種針:用于莖尖剝離和愈傷組織轉(zhuǎn)移;切割盤(pán):用于原球莖、愈傷組織、植物器官等切割分離。3.顯微鏡:包括雙目體視顯微鏡(解剖鏡)、生物顯微鏡、倒置顯微鏡和電子顯微鏡,用于剝離莖尖和進(jìn)行培養(yǎng)物的觀察、分析、拍照等。(三)培養(yǎng)設(shè)備與用具1.培養(yǎng)架:試管苗在培養(yǎng)間里培養(yǎng)時(shí)通常擺放在培養(yǎng)架上。培養(yǎng)架大多由金屬制成,一般設(shè)58層,最低一層離地高約20cm,其他每層間隔30cm左右。培養(yǎng)架長(zhǎng)度根據(jù)日光燈的長(zhǎng)度而設(shè)計(jì),如采用40W日光燈,則長(zhǎng)1.3m,寬度一般為60cm。2.恒溫振蕩器:用于液體培養(yǎng)時(shí)改善培養(yǎng)過(guò)程的氧氣供應(yīng)狀況。3.光照培養(yǎng)箱:對(duì)于一些對(duì)環(huán)境條件要求特別嚴(yán)格的培

14、養(yǎng)物,可培養(yǎng)在能自動(dòng)調(diào)控溫度、濕度、光照等的智能光照培養(yǎng)箱里。4.培養(yǎng)器皿:根據(jù)培養(yǎng)目的和要求不同,可選用不同類(lèi)型和規(guī)格的培養(yǎng)容器。(1)三角瓶:主要用于外植體靜置培養(yǎng)、振蕩培養(yǎng)或試管苗繼代培養(yǎng)。規(guī)格有50mL,l00mL,150mL,250mL,500mL等,一般使用l50mL三角瓶。優(yōu)點(diǎn):其培養(yǎng)面積大,利于組織生長(zhǎng);透光度好;由于瓶口較小,不易污染。(2)試管:主要用于莖尖培養(yǎng)、液體培養(yǎng)。試管要求口徑大,長(zhǎng)度稍短、以2cm15cm、2.5cm15cm、3cm15cm 為宜。優(yōu)點(diǎn):占空間少,單位面積容納的數(shù)量多。(3)果醬瓶:主要用于繼代和生根培養(yǎng)。優(yōu)點(diǎn):在工廠化大批量生產(chǎn)時(shí)使用,價(jià)格低廉,

15、成本低;口徑較大,便于操作。缺點(diǎn):污染率較高;透光性稍差。(4)塑料瓶:主要用于蘭科植物的培養(yǎng)。有100mL、150mL、200mL、250mL的規(guī)格。優(yōu)點(diǎn):密封好、透氣性差、瓶?jī)?nèi)濕度大;質(zhì)輕,便于操作,不易破損,污染率低;長(zhǎng)方盒形的培養(yǎng)株數(shù)多,且疊摞起來(lái)節(jié)約空間。缺點(diǎn):可重復(fù)利用性較差。(四)稱(chēng)量設(shè)備與用具1.天平:用于進(jìn)行瓊脂、蔗糖和各種藥品的稱(chēng)量,需要有稱(chēng)量微量元素和植物激素等的分析天平;稱(chēng)量大量元素、蔗糖和瓊脂等的托盤(pán)天平等不同精度的天平。2.燒杯:用于配制培養(yǎng)基母液時(shí)溶解各種化合物,規(guī)格有501000mL不等。3.量筒:用于量取不同體積的液體,規(guī)格有501000mL不等。4.試劑瓶:

16、用于貯存不同容量的溶液,規(guī)格有501000mL不等。5.移液管:用于吸取各種用量較少的母液,規(guī)格有0.110mL不等。6.容量瓶:用于配制培養(yǎng)基母液時(shí)進(jìn)行定容,規(guī)格有501000mL不等。(五)環(huán)境控制設(shè)備與用具1.空調(diào)機(jī):自動(dòng)控制植物組織培養(yǎng)廠房的溫度,為培養(yǎng)物提供最適宜的溫度條件。2.冰箱:用于母液和某些試劑的貯存及培養(yǎng)材料的保鮮或與處理等。3.光照時(shí)控器:用于自動(dòng)控制培養(yǎng)間的光照時(shí)間。(六)其它設(shè)備與用具1.磁力攪拌器:磁力攪拌器用于加速攪拌難溶的物質(zhì),如各種化學(xué)物質(zhì)等。磁力攪拌器還可加熱,加快物質(zhì)的溶解。2.蒸餾水發(fā)生器或純水機(jī):用于制備配制母液和培養(yǎng)基的蒸餾水或去離子水。3.藥品柜:

17、用于存放各種化學(xué)藥品。4.加熱設(shè)備:制備固體培養(yǎng)基時(shí)需加熱使固化劑溶化,因此需要加熱設(shè)備如液化氣灶、電爐、恒溫水浴鍋等。5.pH計(jì):用于精確測(cè)量和調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH,大規(guī)模生產(chǎn)中一般用精密pH試紙代替。III.作業(yè)1.植物組織培養(yǎng)廠房的設(shè)計(jì)原則和要求有哪些?2.植物組織培養(yǎng)的工藝流程是怎樣的?3.組建一個(gè)植物組織培養(yǎng)生產(chǎn)車(chē)間應(yīng)包括哪幾部分,各部分的設(shè)計(jì)要求以及主要功能是什么?4.植物組織培養(yǎng)需要哪些基本設(shè)備,各有何作用?第三節(jié) 植物組織培養(yǎng)操作技術(shù)(1)一、授課章節(jié)第三節(jié) 植物組織培養(yǎng)操作技術(shù)(1)。二、學(xué)時(shí)安排2學(xué)時(shí)。三、教學(xué)目標(biāo)1掌握組培的一般工作程序。2掌握不同類(lèi)型培養(yǎng)器皿和用具的洗滌技術(shù)

18、。3了解常用消毒滅菌方法的原理,掌握其操作技術(shù),能根據(jù)物品種類(lèi)正確選用消毒滅菌方法。四、教學(xué)重點(diǎn)、難點(diǎn)分析重點(diǎn):常用的消毒滅菌技術(shù)。難點(diǎn):滅菌和消毒的區(qū)別及無(wú)菌意識(shí)的樹(shù)立。五、教具電化教學(xué)設(shè)備。六、教學(xué)方法講授法,演示法。七、教學(xué)過(guò)程.導(dǎo)入提問(wèn):植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的基本構(gòu)成。本次課主要介紹的是植物組織培養(yǎng)洗滌和消毒滅菌技術(shù)。II.新課一、洗滌技術(shù)植物組織培養(yǎng)除了要對(duì)培養(yǎng)材料和接種用具進(jìn)行嚴(yán)格消毒外,各種用具更要求洗滌清潔,因?yàn)楦鞣N滅菌方法的有效作用時(shí)間都是以材料或用具清潔為前提的。(一)洗滌液1.洗衣粉、洗潔精洗滌液 適用于玻璃器皿和金屬類(lèi)器具的洗滌。2.鉻酸洗滌液 由重鉻酸鉀和濃硫酸混合而成

19、,屬?gòu)?qiáng)氧化劑,對(duì)無(wú)機(jī)離子、灰塵效果好,對(duì)油污無(wú)效。鉻酸洗滌液的配制:稱(chēng)取重鉻酸鉀50g,加入1L蒸餾水,加熱攪拌至完全溶解;冷卻后注入90mL濃硫酸,混合均勻即可。剛配好的洗液是棕紅色,反復(fù)使用至變成青褐色則失效。【注意事項(xiàng)】(1)配制時(shí)重鉻酸鉀溶液一定要冷卻后才能加濃硫酸,且只能把濃硫酸緩慢加入重鉻酸鉀溶液中,決不能將重鉻酸鉀溶液或蒸餾水倒入濃硫酸中。(2)由于鉻酸洗滌液具有極強(qiáng)的氧化能力和腐蝕作用,故不要用手直接接觸洗滌液。(二)各類(lèi)器皿和用具的洗滌方法1.新的玻璃器皿:使用前先用1%稀鹽酸浸泡1224h用毛刷蘸洗衣粉水刷洗干凈流水沖洗34次最后用蒸餾水沖淋1遍晾干(或烘干)后備用。2.已

20、用過(guò)的培養(yǎng)器皿:除去容器內(nèi)的殘?jiān)詠?lái)水沖洗浸泡在洗衣粉水中1530min用毛刷刷洗干凈流水沖洗34次最后用蒸餾水沖淋1遍晾干(或烘干)后備用。3.已被霉菌等雜菌污染的器皿:121高溫高壓蒸汽滅菌30min趁熱倒去殘?jiān)詠?lái)水沖洗浸泡在洗衣粉水中1530min用毛刷刷洗干凈流水沖洗34次最后用蒸餾水沖淋1遍晾干(或烘干)后備用。4.移液管、量筒等量器:鉻酸洗滌液中浸泡2h以上取出后在流水中沖洗30min蒸餾水沖淋1次晾干(或烘干)后備用。5.載玻片和蓋玻片:洗滌液中浸泡數(shù)小時(shí)水洗綢布擦干放在95%的灑精中備用。6.解剖刀、鑷子、剪刀等:新購(gòu)置金屬器皿因其上有潤(rùn)滑油或防銹油,用蘸有四氯化碳的棉布擦去

21、油脂,再用濕布擦凈,干燥備用。每次使用后先用洗衣粉水刷洗,再用酒精擦拭。二、滅菌與消毒技術(shù)(一)滅菌與消毒的區(qū)別1有菌和無(wú)菌的范疇有菌的范疇是:凡是暴露在空氣中的物體,接觸自然水源的物體,至少它的表面都是有菌的。無(wú)菌的范疇是:經(jīng)高溫灼燒或一定時(shí)間蒸煮過(guò)后的物體,經(jīng)其他理化滅菌方法處理后的物體一般可認(rèn)為是無(wú)菌的。2.滅菌與消毒的區(qū)別滅菌是指用物理或化學(xué)方法殺死物體表面和孔隙內(nèi)一切微生物或生物體。消毒是指殺死、消除或充分抑制部分微生物,使之不再發(fā)生危害作用。由滅菌和消毒的含義可以看出,二者的主要區(qū)別是:滅菌是把所有有生命的物質(zhì)全部殺死;而消毒主要?dú)⑺阑蛞种莆矬w表面的微生物,但芽孢、厚垣孢子一般不會(huì)

22、死亡。(二)常用的消毒滅菌方法(三)消毒滅菌技術(shù)1.環(huán)境消毒:方法主要有空氣過(guò)濾滅菌、紫外線照射消毒、噴霧消毒和熏蒸消毒等。空氣過(guò)濾滅菌:成規(guī)模的植物組織培養(yǎng)車(chē)間可采用空氣過(guò)濾系統(tǒng)對(duì)整個(gè)環(huán)境進(jìn)行空氣過(guò)濾滅菌,這種方法投入較高,操作要求比較嚴(yán)格,一般較少采用。組織培養(yǎng)中普遍采用的是對(duì)無(wú)菌操作的微環(huán)境進(jìn)行空氣過(guò)濾滅菌,如超凈工作臺(tái)的局部無(wú)菌環(huán)境。紫外線照射消毒:利用紫外光波照射滅菌,細(xì)菌吸收紫外線后,蛋白質(zhì)和核酸發(fā)生結(jié)構(gòu)變化,引起細(xì)菌的染色體變異,造成死亡。緩沖間、接種間、培養(yǎng)間等均可采用紫外線照射消毒,一般照射2030min。噴霧消毒:利用70%75%的酒精或0.2%的新潔爾滅對(duì)環(huán)境進(jìn)行噴霧,既

23、可以起到直接殺死環(huán)境中微生物的作用,又可以使飄浮的塵埃降落,防止塵埃上附著的雜菌污染培養(yǎng)基和培養(yǎng)材料。熏蒸消毒:利用加熱焚燒、氧化等方法,使化學(xué)藥劑變?yōu)闅怏w狀態(tài)擴(kuò)散到空氣中,以殺死空氣和物體表面的微生物。常用熏蒸劑是甲醛,熏蒸時(shí),按2mLm3用量,將甲醛置于廣口容器中,加0.2g/m3高錳酸鉀氧化揮發(fā)。熏蒸時(shí),房間可預(yù)先噴濕,關(guān)閉緊密,24h后打開(kāi)門(mén)窗通風(fēng)。2.用具的消毒滅菌:根據(jù)用具種類(lèi)不同分別采用干熱滅菌、濕熱滅菌、浸泡消毒、擦拭消毒等方法。干熱滅菌:利用烘箱進(jìn)行烘烤滅菌的方法,適用于各種玻璃器皿和器械的滅菌消毒。方法是將清洗后的玻璃器皿和器械妥為包扎,放入箱內(nèi),將箱溫控制在150170,

24、烘烤120min,即可達(dá)到滅菌效果。在干熱條件下,細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞抗熱性大為提高,故能源消耗大,又浪費(fèi)時(shí)間,所以目前多采用濕熱滅菌代替,接種工具也可采用消毒器烘烤和酒精燈外焰灼燒的方法消毒。濕熱滅菌:適用于培養(yǎng)基、玻璃器皿、棉塞、布制品及金屬用具等的滅菌,一般滅菌掌握在0.10.15MPa壓力下2030min。浸泡消毒:在無(wú)菌操作時(shí),把鑷子、剪子、解剖刀等浸入70%75%的酒精中浸泡,使用之前取出在酒精燈外焰上灼燒,待冷卻后使用。擦拭消毒:接種用具及超凈工作臺(tái)表面等使用前可用70%酒精或0.10.2%新潔爾滅溶液進(jìn)行擦拭消毒。3.培養(yǎng)基滅菌:培養(yǎng)基滅菌一般采用濕熱滅菌,特殊情況下采用過(guò)濾無(wú)菌。濕

25、熱滅菌:采用高壓蒸汽滅菌鍋滅菌。過(guò)濾滅菌:主要針對(duì)一些不能處于高溫高壓環(huán)境的物質(zhì),如GA3、IAA、ABA(脫落酸)、ZT(玉米素)、部分維生素、多數(shù)抗生素和酶。過(guò)濾滅菌的原理是細(xì)菌濾膜的網(wǎng)孔直徑為0.45m以下,當(dāng)溶液通過(guò)濾膜后,細(xì)菌的細(xì)胞和真菌的孢子(直徑1m以上)等因大于濾膜網(wǎng)孔直徑而被阻。4.外植體消毒:從外界或室內(nèi)選取的植物材料,都不同程度地帶有各種微生物,因此,植物材料必須經(jīng)嚴(yán)格的表面消毒處理。接種的植物材料叫做外植體。外植體的消毒要求比較嚴(yán)格,既要能有效殺滅微生物,又要保證植物組織盡量少受傷害。外植體一般采用浸泡消毒的方法,具體方法在以后課程中講授。III.作業(yè)1.不同的培養(yǎng)器皿

26、怎樣選擇與洗滌?2.植物組織培養(yǎng)環(huán)境如何進(jìn)行消毒滅菌?3過(guò)濾滅菌的技術(shù)原理?第三節(jié) 植物組織培養(yǎng)操作技術(shù)(2)一、授課章節(jié)第三節(jié) 植物組織培養(yǎng)操作技術(shù)(2)。二、學(xué)時(shí)安排2學(xué)時(shí)。三、教學(xué)目標(biāo)1掌握培養(yǎng)基的作用。2掌握培養(yǎng)基中生長(zhǎng)調(diào)控物質(zhì)的作用。3了解培養(yǎng)基的類(lèi)型。四、教學(xué)重點(diǎn)、難點(diǎn)分析重點(diǎn):培養(yǎng)基的基本成分。難點(diǎn):培養(yǎng)基中生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的作用。五、教具電化教學(xué)設(shè)備。六、教學(xué)方法講授法,演示法。七、教學(xué)過(guò)程.導(dǎo)入培養(yǎng)基是進(jìn)行植物組織培養(yǎng)的基質(zhì),進(jìn)行植物組織培養(yǎng)必須掌握培養(yǎng)基的基本知識(shí),今天我們就學(xué)習(xí)培養(yǎng)基的種類(lèi)和基本成分。II.新課三、培養(yǎng)基制備技術(shù)(一)配制培養(yǎng)基的目的配制培養(yǎng)基的目的是人為提供

27、離體培養(yǎng)材料的營(yíng)養(yǎng)源。配制的不同培養(yǎng)基,是為滿(mǎn)足不同類(lèi)型植物材料對(duì)營(yíng)養(yǎng)的不同需要。沒(méi)有一種培養(yǎng)基能夠適合一切類(lèi)型的植物組織或器官,在建立一項(xiàng)新的培養(yǎng)系統(tǒng)時(shí),首先必須找到一種合適的培養(yǎng)基,培養(yǎng)才有可能成功。(二)培養(yǎng)基的種類(lèi)1.培養(yǎng)基的種類(lèi)劃分培 養(yǎng) 基 種 類(lèi)固體培養(yǎng)基:在液體培養(yǎng)基中加入一定量凝固劑,使其成為固體狀態(tài)。根據(jù)形態(tài)液體培養(yǎng)基:培養(yǎng)基中沒(méi)有凝固劑為液體狀態(tài)。根據(jù)培養(yǎng)階段根據(jù)培養(yǎng)進(jìn)程根據(jù)營(yíng)養(yǎng)水平初代培養(yǎng)基:初代培養(yǎng)階段所用的培養(yǎng)基。繼代培養(yǎng)基:繼代培養(yǎng)階段所用的培養(yǎng)基。完全培養(yǎng)基:在基本培養(yǎng)基中加入適宜的植物激素和有機(jī)附加物的培養(yǎng)基?;九囵B(yǎng)基:只含有無(wú)機(jī)鹽、蔗糖、維生素和水等最基本

28、成分的合成培養(yǎng)基。如Ms、White、Nitsch、N6等培養(yǎng)基。誘導(dǎo)培養(yǎng)基:初代培養(yǎng)時(shí)誘導(dǎo)外植體生長(zhǎng)與脫分化的培養(yǎng)基。增殖培養(yǎng)基:繼代培養(yǎng)中促進(jìn)培養(yǎng)物快速增殖的培養(yǎng)基,也稱(chēng)擴(kuò)繁培養(yǎng)基。生根培養(yǎng)基:誘導(dǎo)試管苗生根的培養(yǎng)基。2.常用培養(yǎng)基的配方和特點(diǎn) 目前已公開(kāi)報(bào)道的基本培養(yǎng)基有許多種類(lèi),各有不同的特點(diǎn)和適用范圍,在植物組織培養(yǎng)生產(chǎn)中應(yīng)根據(jù)不同的植物種類(lèi)和培養(yǎng)部位及不同的培養(yǎng)目的選用不同的培養(yǎng)基。常用的培養(yǎng)基配方:表1 常用培養(yǎng)基配方含量(mg/L) MS(1962)B5(1968)White(1943)SH(1972)Knudson C(1946)VW(1949)N6(1974)(NH4)2S

29、04NH4N03KN03Ca(N03)24H20CaCl22H20Ca3(PO4)21650l900440134250015080200250020050010005005252004632830166MgS047H20KH2PO4NaH2P04H20Na2SO4Na2EDTA37017037.325015037.3720172004001525025025025018540037.3FeSO47H20Fe2(SO4)3KClFe2(C4H4O6)327.827.82.56520252827.8NH4H2PO4MnSO4H20MnS044H20ZnSO47H20H3B03KINa2Mo042H

30、20MoO3CuSO45H20CoCl26H2022.38.66.20.830.250.0250.025102.03.00.750.250.0250.025531.50.750.0010.01300101.05.01.00.10.20.17.57.54.43.81.60.8鹽酸硫胺素VBl煙酸鹽酸吡哆醇VB6肌醇甘氨酸0.10.50.51002.0101.01.01000.10.30.135.05.05.0100010.50.52蔗糖pH300005.8200005.5200005.6300005.8200005.8200005.5500005.8表2 常用基本培養(yǎng)基的特點(diǎn)基本培養(yǎng)基種類(lèi)設(shè)計(jì)由

31、來(lái)特點(diǎn)適用范圍MS1962年由Murashige和Skoog為培養(yǎng)煙草細(xì)胞而設(shè)計(jì)無(wú)機(jī)鹽和離子濃度較高,為較穩(wěn)定的平衡溶液;它的硝酸鹽和銨鹽含量較其他培養(yǎng)基為高,比例也比較合適,不需要添加更多的有機(jī)附加物。廣泛地用于植物的器官、花藥、細(xì)胞和原生質(zhì)體培養(yǎng)B51968年由Gamborg等為培養(yǎng)大豆根細(xì)胞而設(shè)計(jì)除含有較高的鉀鹽外,還含有較低的氨態(tài)氮和較高的鹽酸硫胺素適合雙子葉植物,尤其木本植物的培養(yǎng)White1943年由White為培養(yǎng)番茄根尖而設(shè)計(jì)無(wú)機(jī)鹽數(shù)量較低,提高了MgSO4的濃度適于生根培養(yǎng)SH1972年由Schenk和Hidebrandt設(shè)計(jì)鹽分濃度較高,銨態(tài)氮含量較低,鹽酸硫胺素和硝酸鉀含

32、量較高在不少單子葉和雙子葉植物的組培中應(yīng)用效果較好Knudson C1922年由Knudson為蘭科種子培養(yǎng)而設(shè)計(jì),后經(jīng)多次改良成分簡(jiǎn)單,不能滿(mǎn)足大多數(shù)植物組織細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)適用于蘭科植物種子培養(yǎng)和萌發(fā)VWVacin 和Went 在1949年設(shè)計(jì)培養(yǎng)基的總離子強(qiáng)度稍低些,磷以磷酸鈣的形式供給適用于氣生蘭的組培N61974年朱至清等為水稻等禾谷類(lèi)作物花藥培養(yǎng)而設(shè)計(jì)成分較簡(jiǎn)單,KN03和(NH4)2S04含量高適用于單子葉植物花藥培養(yǎng),廣泛應(yīng)用于小麥、水稻及其他植物的花藥培養(yǎng)(三)培養(yǎng)基的組成培養(yǎng)基主要有水、無(wú)機(jī)鹽、有機(jī)物、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)、培養(yǎng)基的支持材料五大類(lèi)組成。1.水 水是植

33、物原生質(zhì)體的組成成分,也是一切代謝過(guò)程的介質(zhì)和溶媒。它是生命活動(dòng)過(guò)程中不可缺少的物質(zhì)。配制培養(yǎng)基母液時(shí)要用蒸餾水,以確保母液及培養(yǎng)基成分的精確性,防止貯藏過(guò)程發(fā)霉變質(zhì),大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)可用自來(lái)水。但在少量研究上盡量用蒸餾水,以防成分的變化引起不良效果。2.無(wú)機(jī)元素(1)大量元素指濃度大于0.5 mmolL的元素,有N,P,K,Ca,Mg,S等。常由KN03、NH4NO3、KH2P04、NaH2P04、KCl、MgS047H20、CaCl22H20等化合物來(lái)提供。(2)微量元素指濃度小于0.5 mmolL的元素,F(xiàn)e,B,Mn,Cu,Mo,Co等。鐵是一些氧化酶、細(xì)胞色素氧化酶、過(guò)氧化氫酶等的組成成

34、分。同時(shí),它又是葉綠素形成必要的。培養(yǎng)基中的鐵對(duì)胚的形成、芽的分化和幼苗轉(zhuǎn)綠有促進(jìn)作用。在制作培養(yǎng)基時(shí)不用Fe2(S04)3和FeCl3(因其pH在5.2以上,易形成Fe(OH)3的不溶性沉淀),而用FeS047H20和Na2-EDTA結(jié)合成螯合物使用。B,Mn,Zn,Cu,Mo,Co等,也是植物組織培養(yǎng)中不可缺少的元素,缺少這些物質(zhì)會(huì)導(dǎo)致生長(zhǎng)發(fā)育異常。3.有機(jī)化合物(1)糖類(lèi):這類(lèi)有機(jī)物的作用一是培養(yǎng)物賴(lài)以生長(zhǎng)的碳源;二是使培養(yǎng)基維持一定的滲透壓。 種類(lèi):常用的有蔗糖、葡萄糖、果糖,麥芽糖、半乳糖、甘露糖等在組織培養(yǎng)中也有應(yīng)用。 使用濃度:一般在23。在大規(guī)模生產(chǎn)時(shí),可用食用的綿白糖代替。(

35、2)維生素類(lèi):這類(lèi)化合物在植物細(xì)胞中主要以各種輔酶的形式參與多種代謝活動(dòng),對(duì)生長(zhǎng)、分化等有很好的促進(jìn)作用。 種類(lèi):硫胺素(維生素B1)、吡哆醇(維生素B6)、煙酸(維生素B3,又稱(chēng)維生素PP)、泛酸(維生素B5)、生物素(維生素H)、鈷胺素(維生素B12)、葉酸(維生素B11)等。 使用濃度:0.11.0 mg/L(3)肌醇(環(huán)己六醇): 作用:在糖類(lèi)的相互轉(zhuǎn)化中起重要作用;參與細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的構(gòu)建;能促進(jìn)愈傷組織的生長(zhǎng)以及胚狀體和芽的形成;對(duì)組織和細(xì)胞的繁殖、分化有促進(jìn)作用。 使用濃度:一般為1OO mgL。(4)氨基酸: 作用:是很好的有機(jī)氮源,可被細(xì)胞直接吸收利用。 常用種類(lèi):甘氨酸、精

36、氨酸、谷氨酸、谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等。有時(shí)應(yīng)用水解乳蛋白(LH)或水解酪蛋白(CH),但由于它們營(yíng)養(yǎng)豐富,極易引起污染。如在培養(yǎng)中無(wú)特別需要,以不用為宜。(5)天然復(fù)合物:其成分比較復(fù)雜,大多含氨基酸、激素、酶等一些復(fù)雜化合物。它對(duì)細(xì)胞和組織的增殖與分化有明顯的促進(jìn)作用,但對(duì)器官的分化作用不明顯。它的成分大多不清楚,所以一般盡量不使用。 椰乳 是椰子的液體胚乳。它是使用最多、效果最大的一種天然復(fù)合物,一般使用濃度在1020。它在愈傷組織和細(xì)胞培養(yǎng)中有促進(jìn)作用。在馬鈴薯莖尖分生組織和草莓微莖尖培養(yǎng)中起明顯的促進(jìn)作用,但莖尖組織的大小若超過(guò)1 mm時(shí),椰乳就不發(fā)生作用。 香蕉 用量為

37、150200 g/L。主要在蘭花的組織培養(yǎng)中應(yīng)用,對(duì)原球莖增殖有明顯促進(jìn)效果,并有利于壯苗與生根。 馬鈴薯 去掉皮和芽后,加水煮30 min,經(jīng)過(guò)過(guò)濾,取其濾液使用。用量為150200 gL。添加后可得到健壯的植株。4.植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì) 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)是培養(yǎng)基的關(guān)鍵性物質(zhì),對(duì)植物組織培養(yǎng)起著決定性作用,控制著培養(yǎng)物的脫分化、再分化和形態(tài)建成。(1)生長(zhǎng)素類(lèi): 作用:在組織培養(yǎng)中,生長(zhǎng)素主要被用于誘導(dǎo)愈傷組織形成,誘導(dǎo)根的分化和促進(jìn)細(xì)胞分裂、伸長(zhǎng)生長(zhǎng)。 種類(lèi)及活性:常用種類(lèi)有IAA(吲哚乙酸)、NAA(萘乙酸)、IBA(吲哚丁酸)、2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)等。作用能力的強(qiáng)弱順序?yàn)椋?

38、,4-DNAAIBAIAA。 穩(wěn)定性:IAA是天然存在的生長(zhǎng)素,高溫高壓易被破壞,也易被細(xì)胞中的IAA分解酶降解,受光也易分解,故要避光貯存,過(guò)濾滅菌。其他3種生長(zhǎng)素為人工合成,耐高溫高壓,不易被分解破壞。特別是NAA穩(wěn)定性好,活性較高,價(jià)格低廉,所以應(yīng)用最普遍。 溶解性:生長(zhǎng)素不溶于水,IAA、NAA、IBA配制時(shí)可先用少量95酒精助溶。2,4-D可用0.1 molL的NaOH或KOH助溶。(2)細(xì)胞分裂素類(lèi): 作用:誘導(dǎo)芽的分化促進(jìn)側(cè)芽萌發(fā)生長(zhǎng),細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素相互作用,當(dāng)組織內(nèi)細(xì)胞分裂素生長(zhǎng)素的比值高時(shí),誘導(dǎo)愈傷組織或器官分化出不定芽。促進(jìn)細(xì)胞分裂與擴(kuò)大。抑制根的分化。因此,細(xì)胞分裂素

39、多用于誘導(dǎo)不定芽的分化、莖、苗的增殖,而避免在生根培養(yǎng)時(shí)使用。 種類(lèi)及活性:這類(lèi)激素是腺嘌呤的衍生物,包括6-BA(6-芐氨基嘌呤)、Kt(激動(dòng)素)、Zt(玉米素)等。作用能力的強(qiáng)弱順序是:ZT6-BAKT,常用的是人工合成的、性能穩(wěn)定的、價(jià)格適中的6-BA。 溶解性:細(xì)胞分裂素不溶于水,也不溶于酒精,一般可溶于0.1mol/L的鹽酸或NaOH溶液中。(3)赤霉素(GA):有20多種,培養(yǎng)基中添加的是GA3,主要用于促進(jìn)幼苗莖的伸長(zhǎng)生長(zhǎng),促進(jìn)不定胚發(fā)育成小植株;此外,赤霉素還用于打破休眠,促進(jìn)種子、塊莖、鱗莖等提前萌發(fā)。一般在器官形成后,添加赤霉素可促進(jìn)器官或胚狀體的生長(zhǎng)。赤霉素溶于酒精,配制

40、時(shí)可用少量95酒精助溶。赤霉素不耐熱,高壓滅菌后將有70-100失效,應(yīng)當(dāng)過(guò)濾滅菌。生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的使用量甚微,一般用mgL表示濃度。在組織培養(yǎng)中生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的使用濃度,因植物的種類(lèi)、部位、時(shí)期、內(nèi)源激素等的不同而異,一般生長(zhǎng)素濃度的使用為0.055 mgL,細(xì)胞分裂素0.0510 mgL。5.培養(yǎng)基的其他成分(1)瓊脂:在固體培養(yǎng)時(shí)瓊脂是最好的固化劑。瓊脂是一種由海藻中提取的高分子碳水化合物,本身并不提供任何營(yíng)養(yǎng)。瓊脂能溶解在90以上熱水中,成為溶膠,冷卻至40即凝固為固體狀凝膠。瓊脂的用量在610 gL之間。一般瓊脂以顏色淺、透明度好、潔凈的為上品。瓊脂的凝固能力除與原料、廠家的加工方式有關(guān)

41、外,還與高壓滅菌時(shí)的溫度、時(shí)間、pH等因素有關(guān),長(zhǎng)時(shí)間的高溫會(huì)使凝固能力下降,過(guò)酸過(guò)堿加之高溫會(huì)使瓊脂發(fā)生水解,喪失凝固能力。時(shí)間過(guò)久,瓊脂變褐,也會(huì)逐漸喪失凝固能力。加入瓊脂的固體培養(yǎng)基與液體培養(yǎng)基相比,優(yōu)點(diǎn)在于操作簡(jiǎn)便,通氣問(wèn)題易于解決,便于經(jīng)常觀察研究等,缺點(diǎn)是培養(yǎng)物的吸收面積??;各種養(yǎng)分在瓊脂中擴(kuò)散較慢,影響?zhàn)B分的充分利用;培養(yǎng)物排出的一些代謝廢物,聚集在吸收表面,對(duì)組織產(chǎn)生毒害作用。(2)抗生物質(zhì):抗生物質(zhì)有青霉素、鏈霉素、慶大霉素等,用量在520 mgL之間。添加抗生物質(zhì)可防止菌類(lèi)污染,減少培養(yǎng)中材料的損失??股馗饔衅湟志V,要加以選擇試用,也可兩種抗生素混用。但應(yīng)當(dāng)注意抗生素對(duì)

42、植物組織的生長(zhǎng)也有抑制作用。(3)抗氧化物:培養(yǎng)基中添加抗氧化物是為了抑制外植體和培養(yǎng)物褐變。常用的抗氧化劑有半胱氨酸、維生素C、檸檬酸、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等。(4)活性炭:活性炭有很強(qiáng)的吸附作用,它可以吸附非極性物質(zhì)和色素等大分子物質(zhì),包括瓊脂中所含的雜質(zhì),培養(yǎng)物分泌的酚類(lèi)、醌類(lèi)物質(zhì)及激素等。通常使用濃度為0.110gL。培養(yǎng)基中添加活性炭的作用:防止褐化;促進(jìn)生根;降低玻璃苗的產(chǎn)生頻率;活性炭在胚胎培養(yǎng)中也有一定作用。但是,活性炭具有副作用:吸附培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì);削弱瓊脂的凝固能力,添加時(shí)須注意。III.作業(yè)1.培養(yǎng)基的作用是什么?2.培養(yǎng)基一般包括哪些基本成分?3. 培養(yǎng)基中

43、添加的植物生長(zhǎng)調(diào)控物質(zhì)有哪些? 各有什么作用?第三節(jié) 植物組織培養(yǎng)操作技術(shù)(3)一、授課章節(jié)第三節(jié) 植物組織培養(yǎng)操作技術(shù)(3)。二、學(xué)時(shí)安排2學(xué)時(shí)。三、教學(xué)目標(biāo)1掌握培養(yǎng)基母液的配制技術(shù)。2掌握培養(yǎng)基的配制、分裝包扎技術(shù)。3掌握培養(yǎng)基高壓滅菌技術(shù)。4掌握無(wú)菌操作技術(shù)。四、教學(xué)重點(diǎn)、難點(diǎn)分析重點(diǎn):1培養(yǎng)基母液配制。2培養(yǎng)基的制備技術(shù)。3培養(yǎng)基的高壓蒸汽滅菌。4無(wú)菌操作技術(shù)。難點(diǎn):1培養(yǎng)基母液、培養(yǎng)基配制的計(jì)算。2無(wú)菌操作技術(shù)步驟的剖析。五、教具電化教學(xué)設(shè)備、試管苗、接種工具、培養(yǎng)基。六、教學(xué)方法講授法,模擬實(shí)驗(yàn)法。七、教學(xué)過(guò)程.導(dǎo)入提問(wèn):培養(yǎng)基的作用。復(fù)習(xí):培養(yǎng)基的基本成分。II.新課(四)培養(yǎng)

44、基的配制1.培養(yǎng)基母液的配制:所謂母液是欲配制培養(yǎng)液的濃縮液,也稱(chēng)貯備液。母液配制的目的一是方便快速配制培養(yǎng)基,二是保證各物質(zhì)成分的準(zhǔn)確性及配制時(shí)的快速移取。(1)母液配制方法單配法:將培養(yǎng)基配方中的各種成分分別配成一定濃度的母液。一般mg/mL表示?;炫浞ǎ簩最?lèi)營(yíng)養(yǎng)成分按配方中的用量擴(kuò)大一定倍數(shù)稱(chēng)量,分別溶解后各類(lèi)混合在一起定容到一定體積配成混合母液。(2)母液配制流程確定培養(yǎng)基配方確定母液種類(lèi)計(jì)算稱(chēng)量溶解混合定容分裝貼標(biāo)簽冰箱保存記錄(3)母液配制要求母液濃縮倍數(shù):大量元素1020倍;微量元素100200倍;鐵鹽100倍;有機(jī)物100200倍。選用蒸餾水,分析純或化學(xué)純?cè)噭?,防止沉淀。?/p>

45、素母液濃度:0.51mg/mL,1次配成50mL或100mL(4)藥品用量的計(jì)算:配制母液時(shí)藥品用量(mg)=配方用量(mg)濃縮倍數(shù)制備容量(L)(5)母液配制技術(shù) 以MS培養(yǎng)基為例,配制過(guò)程如下:表1 MS培養(yǎng)基母液配制(單位:mg/L)母液種類(lèi)成分規(guī)定量擴(kuò)大倍數(shù)稱(chēng)取量母液體積(mL)配1L培養(yǎng)基吸取量(mL)大量元素KNO3NH4N03MgSO47H20KH2P04CaCl22H2O190016503701704401019000165003700170044001000100微量元素MnS044H20ZnS047H20H3B03KINa2Mo042H20CuS045H20CoCl26H

46、2022.38.66.20.830.250.0250.025100223086062083252.52.5l00010鐵鹽Na2EDTAFeS044H2037.327.810037302780100010有機(jī)物甘氨酸鹽酸硫胺素鹽酸吡哆醇煙酸肌醇2.00.10.50.510010020010505010000100010大量元素母液 配成濃縮10倍的母液。用感量0.01g托盤(pán)天平按表2-4稱(chēng)取藥品,分別加入100mL左右蒸餾水中,再用磁力攪拌器攪拌促進(jìn)溶解,然后倒入1000mL容量瓶中,再加水定容至刻度,成為10倍母液。注意Ca2+和SO42、PO43易發(fā)生沉淀,因此CaCl22H2O充分溶解后

47、最后加入。微量元素母液 配成濃縮100倍的母液。用感量0.0001g分析天平按表2-4準(zhǔn)確稱(chēng)取藥品后,分別溶解,混合后加水定容至1000mL。鐵鹽母液 配成濃縮100倍的母液,用感量0.01g托盤(pán)天平按表2-4稱(chēng)取藥品,分別溶解,混合后加水定容至1000mL。有機(jī)物母液 配成濃縮100倍的母液。用感量0.001g分析天平按表2-4分別稱(chēng)取藥品,溶解,混合后加水定容至1000mL。每種激素必須單獨(dú)配成母液,濃度一般配成0.51mgmL,用時(shí)根據(jù)需要取用。多數(shù)激素難溶于水,要先溶于特定溶劑,然后才能加水定容。具體方法為:IAA、IBA、GA、NAA等先溶于少量95的酒精中,再加水定容到一定體積;2

48、,4-D可用少量0.1mol/L的NaOH溶解后,再加水定容到一定體積;Kt和BA先溶于少量0.1mol/L的HCl中再加水定容。(6)母液的保存 將配制好的母液分別倒入試劑瓶中,貼好標(biāo)簽,在標(biāo)簽上注明母液名稱(chēng),配制倍數(shù)與日期。然后放入冰箱內(nèi)4低溫保存,用時(shí)再按比例稀釋。2.培養(yǎng)基的配制(1)培養(yǎng)基配制工藝流程確定培養(yǎng)基配方及用量計(jì)算母液用量移取母液定容玻璃器皿洗滌調(diào)節(jié)pH分裝培養(yǎng)基熬制高壓滅菌干燥稱(chēng)取瓊脂、蔗糖封口標(biāo)識(shí)、記錄(2)培養(yǎng)基制備的操作步驟確定培養(yǎng)基配方及用量:根據(jù)培養(yǎng)對(duì)象、培養(yǎng)目的等,通過(guò)查閱資料及咨詢(xún)等確定培養(yǎng)基配方,然后據(jù)外植體的數(shù)量和試驗(yàn)處理的多少確定培養(yǎng)基的用量。稱(chēng)取瓊脂

49、、蔗糖:用托盤(pán)天平分別稱(chēng)取0.6%1%的瓊脂、2%3%的蔗糖。培養(yǎng)基熬制:量取純凈水放入加熱容器,純凈水的體積應(yīng)少于所配制培養(yǎng)基體積,約占終體積的2/33/4,加入稱(chēng)量好的瓊脂和糖,接通電源加熱。邊加熱邊攪拌,防止糊底和溢出,至完全溶化。母液取用量的計(jì)算:基本培養(yǎng)基配方成分母液取用量(mL)=1000濃縮倍數(shù)制備培養(yǎng)基的體積(L);生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)母液取用量(mL)=配方中的濃度(mg/L)母液濃度(mg/mL) 制備培養(yǎng)基體積(L)移取母液:根據(jù)計(jì)算出的母液用量,按大量元素、微量元素、鐵鹽、有機(jī)成分、植物激素的順序?qū)⒛敢喝〕?,混合。定容:將母液混合液加入到瓊脂完全溶化的培養(yǎng)基中,攪拌混勻,并加水

50、定容到所需體積。調(diào)節(jié)pH:用酸度計(jì)或精密pH試紙測(cè)試培養(yǎng)基溶液的pH(5.56.8),偏堿滴加0.1mol/L的HCl調(diào)整,偏酸滴加0.1mol/L的NaOH調(diào)整,直到達(dá)到配方要求值。分裝:用乳膠管把配制好的培養(yǎng)基趁熱分裝到培養(yǎng)瓶中,100150mL的培養(yǎng)瓶每瓶裝入3035mL左右的培養(yǎng)基,分裝時(shí)數(shù)量要均勻、合適,培養(yǎng)基不沾附瓶口和瓶壁。封口:用合適的封口材料和線繩包扎。標(biāo)識(shí)與記錄:封裝好的培養(yǎng)基做好標(biāo)記放到高壓滅菌鍋中準(zhǔn)備滅菌。3.培養(yǎng)基的高壓滅菌加水:滅菌鍋加水至淹沒(méi)電熱絲(或高低水位線之間)。裝鍋:將培養(yǎng)瓶及培養(yǎng)器械放入高壓滅菌鍋。密封:封閉高壓滅菌鍋各出氣口。加壓:接通電源加壓至0.0

51、5MPa。排氣:斷開(kāi)電源,打開(kāi)排氣閥,排冷氣至壓力為0MPa。穩(wěn)壓:接通電源,繼續(xù)加壓至0.1MPa開(kāi)始計(jì)時(shí),保壓在0.10.15Mpa維持2030min,此時(shí)溫度在121125。降壓:穩(wěn)壓時(shí)間到,關(guān)閉電源自然冷卻至壓力為0MPa。出鍋:開(kāi)鍋后取出培養(yǎng)基冷卻,貯存于37培養(yǎng)箱中培養(yǎng),經(jīng)24h無(wú)雜菌生長(zhǎng),可保存?zhèn)溆谩?.培養(yǎng)基配制、分裝和滅菌時(shí)注意的問(wèn)題(1)培養(yǎng)基熬制時(shí)邊煮邊攪拌,防止糊底。用旺火煮開(kāi),再用文火加熱,直至瓊脂全部融化。(2)配制培養(yǎng)基一定按母液順序依次加入。(3)熬制培養(yǎng)基過(guò)程中,先放入難溶解的瓊脂及有機(jī)附加物(馬鈴薯、香蕉等),最后加入藥劑混合液,因混合液中的有機(jī)物遇熱時(shí)間長(zhǎng)

52、易分解失效。(4)多數(shù)植物適宜的pH在5.66.5,而培養(yǎng)基經(jīng)高壓滅菌pH一般會(huì)降低0.20.3個(gè)單位,故調(diào)節(jié)pH時(shí)應(yīng)比選定pH提高0.20.3個(gè)單位。(5)分裝培養(yǎng)基時(shí),注意不能將培養(yǎng)基溶液噴灑到瓶壁口處,容易落菌污染。(6)滅菌過(guò)程中須完全排除鍋內(nèi)冷水汽,使鍋內(nèi)全部是熱水蒸汽,滅菌才能徹底。(7)培養(yǎng)基滅菌嚴(yán)格按要求時(shí)間進(jìn)行,如超過(guò)時(shí)間,培養(yǎng)基成分發(fā)生變化易失效。(8)培養(yǎng)基滅菌后,立即取出擺平冷卻。取出過(guò)晚凝固差,影響接種轉(zhuǎn)苗質(zhì)量。四、無(wú)菌操作(接種)技術(shù)接種是指把無(wú)菌的植物材料切割,經(jīng)無(wú)菌操作手序,放到培養(yǎng)基上的全部操作過(guò)程。它是組織培養(yǎng)過(guò)程中易于污染的一個(gè)環(huán)節(jié),接種操作必須在無(wú)菌條件

53、下進(jìn)行。在接種前30min打開(kāi)無(wú)菌操作間和超凈工作臺(tái)的紫外燈進(jìn)行環(huán)境滅菌。照射20min后關(guān)閉紫外燈,打開(kāi)風(fēng)機(jī)使超凈工作臺(tái)處于工作狀態(tài)。接種人員先洗凈雙手,在緩沖間換好專(zhuān)用實(shí)驗(yàn)服,并換穿拖鞋等。接種人員上工作臺(tái)后,用70%75%酒精擦拭雙手,然后擦拭工作臺(tái)面。用70%75%酒精擦拭接種工具并反復(fù)灼燒。進(jìn)行外植體表面滅菌與接種:將外植體35個(gè)為一組放入70%75%的酒精溶液浸潤(rùn)1060S取出后再放入2%的次氯酸鈉溶液浸泡1015min用無(wú)菌水反復(fù)沖洗35次(1min/次)放入無(wú)菌吸水紙上吸干水分,進(jìn)行適當(dāng)切割打開(kāi)已準(zhǔn)備好的培養(yǎng)基瓶蓋或封口膜,在酒精燈無(wú)菌圈內(nèi)接入外植體封口。如此反復(fù)操作,直到全部

54、外植體接種完成。注意工具用后及時(shí)滅菌,避免交叉污染。接種完畢,清理干凈工作臺(tái)。標(biāo)識(shí)接種材料并放入培養(yǎng)間培養(yǎng)。III.作業(yè)1.欲配制500毫升MS培養(yǎng)基大量元素母液,需硝酸鉀多少克?2.如何制備MS培養(yǎng)基?3.如何進(jìn)行無(wú)菌操作?第四節(jié) 植物組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)一、授課章節(jié)第四節(jié) 植物組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)。二、學(xué)時(shí)安排2學(xué)時(shí)。三、教學(xué)目標(biāo)1掌握植物組培快繁的流程。2掌握植物組培快繁的程序。四、教學(xué)重點(diǎn)、難點(diǎn)分析重點(diǎn):植物組培快繁的程序。難點(diǎn):初代培養(yǎng)中誘導(dǎo)外植體生長(zhǎng)與分化途徑。五、教具電化教學(xué)設(shè)備, 各培養(yǎng)階段的試管苗。六、教學(xué)方法講授法,演示法。七、教學(xué)過(guò)程.導(dǎo)入本次課主要介紹的是植物組織培養(yǎng)快

55、速繁殖技術(shù)。II.新課一、植物組培快繁的流程母體材料 外植體的選擇 外植體的處理 外植體的表面消毒 外植體的接種 初代培養(yǎng) 繼代培養(yǎng)(多次循環(huán)) 壯苗與生根培養(yǎng) 試管苗馴化與移栽二、植物組培快繁的程序(一)外植體的選擇1.外植體選擇的原則選擇優(yōu)良的種質(zhì) 外植體一定要選擇具有該品種典型特征、遺傳性穩(wěn)定、生長(zhǎng)健壯、無(wú)病蟲(chóng)害的優(yōu)良植株。選擇生理狀態(tài)良好的材料 盡量選擇幼嫩的、生理狀態(tài)良好的材料。選擇生長(zhǎng)旺盛、再生能力強(qiáng)的材料 在生長(zhǎng)季節(jié)選擇年幼的材料,這樣的材料生長(zhǎng)旺盛、再生力強(qiáng),接種成功率高。選擇來(lái)源豐富的材料 為了建立一個(gè)高效而穩(wěn)定的組培快繁體系,需反復(fù)試驗(yàn),所以一定要選用來(lái)源豐富的材料。選擇合

56、適的外植體大小 適宜的外植體大?。呵o尖分生組織0.20.5mm,莖段長(zhǎng)帶12個(gè)節(jié),葉片0.5cm0.5cm。2.外植體的選擇就無(wú)菌短枝扦插、叢生芽培養(yǎng)來(lái)說(shuō),木本植物、能形成莖段的草本植物以采取莖尖和莖段比較適宜;有些草本植物植株短小或沒(méi)有顯著的莖,可用葉片、葉柄、花萼、花瓣作外植體。(二)外植體的處理將采來(lái)的植物材料除去不用的部分,將需要的部分仔細(xì)洗干凈,洗時(shí)可加入洗衣粉清洗,然后再用自來(lái)水沖凈洗衣粉水。洗滌結(jié)束后,進(jìn)入無(wú)菌操作室進(jìn)行消毒接種。(三)外植體的表面滅菌按照無(wú)菌操作技術(shù)中介紹的方法,打開(kāi)電源使超凈工作臺(tái)處于工作狀態(tài),將接種工具、消毒的玻璃器皿、無(wú)菌水、配制好的滅菌劑等放入超凈工作臺(tái)

57、,接種員做好準(zhǔn)備進(jìn)入無(wú)菌操作室,點(diǎn)燃酒精燈,對(duì)接種工具進(jìn)行灼燒滅菌。外植體每35個(gè)為一組放入7075的酒精中浸泡1060S取出后放入2的次氯酸鈉溶液浸泡1015min用無(wú)菌水反復(fù)沖洗35次用已滅菌的剪刀或解剖刀將外植體切割到適當(dāng)大小,準(zhǔn)備接種。(四)外植體的接種先打開(kāi)已準(zhǔn)備好的培養(yǎng)基瓶蓋或封口膜,將三角瓶?jī)A斜拿在手中,使瓶口靠近酒精燈火焰,并將瓶口在火焰上方轉(zhuǎn)動(dòng)灼燒數(shù)秒鐘。然后用鑷子夾取一塊切好的外植體送入瓶?jī)?nèi),輕輕插在培養(yǎng)基上。將葉片背面接觸培養(yǎng)基,莖尖、莖段要按其生長(zhǎng)極性的上下端,正放在培養(yǎng)基上。外植體接種以每瓶放一枚組塊為宜。接完種后,將瓶口在火焰上再灼燒數(shù)秒鐘,蓋上瓶蓋或封口膜。然后再

58、接下一瓶,直到全部接種完畢。最后做好記錄,注明處理材料的物種名稱(chēng)、處理方法、接種日期等。(五)培養(yǎng)1.培養(yǎng)條件(1)溫度 溫度是植物組織培養(yǎng)中的重要因素,大多數(shù)植物組織培養(yǎng)都在2327之間進(jìn)行,一般采用25土2。(2)光照 主要表現(xiàn)在光強(qiáng)和光照時(shí)間方面。組織培養(yǎng)中多采用20003000Lx的光強(qiáng),最常用的周期是16h的光照,8h的黑暗。(3)濕度 影響組織培養(yǎng)的濕度包括以下兩個(gè)方面:培養(yǎng)容器內(nèi)的濕度和培養(yǎng)室內(nèi)環(huán)境的濕度。一般要求培養(yǎng)室內(nèi)要保持7080的相對(duì)濕度。(4)培養(yǎng)基的pH 不同的植物對(duì)培養(yǎng)基最適pH的要求是不同的。大多數(shù)植物適宜的pH在5.66.5之間,一般培養(yǎng)基皆要求5.8。(5)滲

59、透壓 培養(yǎng)基中由于有無(wú)機(jī)鹽類(lèi)、蔗糖等化合物,因此,會(huì)影響滲透壓的變化。通常12個(gè)大氣壓對(duì)植物生長(zhǎng)有促進(jìn)作用,2個(gè)大氣壓以上對(duì)植物生長(zhǎng)有阻礙作用。(6)氣體 氧氣是組織培養(yǎng)中必需的因素,瓶蓋封閉時(shí)要考慮通氣問(wèn)題,可用附有濾氣膜的封口材料。接種時(shí)應(yīng)避免把外植體全部埋入培養(yǎng)基中,以免造成缺氧。2.培養(yǎng)程序初代培養(yǎng)初代培養(yǎng)旨在獲得無(wú)菌材料和無(wú)性繁殖系。即接種某種外植體后,最初的幾代培養(yǎng)。初代培養(yǎng)建立的無(wú)性繁殖系包括:莖梢、芽叢、胚狀體和原球莖等。(1)頂芽和腋芽的發(fā)育頂芽和腋芽在離體培養(yǎng)中都可被誘導(dǎo)而生長(zhǎng)發(fā)育。從芽萌發(fā)變?yōu)橛字?,幼枝繼續(xù)生長(zhǎng),形成新的頂芽和側(cè)芽。再將新形成的芽切割下來(lái)繼續(xù)培養(yǎng),反復(fù)萌生新的枝條,在很短的時(shí)間內(nèi)重復(fù)芽枝苗的再生過(guò)程,就能生產(chǎn)出許多再生小植株。(2)不定芽的發(fā)育由外植體產(chǎn)生不定芽,通常首先要經(jīng)脫分化過(guò)程,形成愈傷組織的細(xì)胞。然后經(jīng)再分化形成器官原基。多數(shù)情況下它先形成芽,后形成根。即外植體產(chǎn)生愈傷組織產(chǎn)生不定芽產(chǎn)生植株。(3)體細(xì)胞胚狀體的發(fā)生與發(fā)育

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