分子生物學(xué)：第三章 蛋白質(zhì)相互作用

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1、第三章第三章 蛋白質(zhì)相互作用蛋白質(zhì)相互作用n蛋白質(zhì)相互作用（蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）是指兩個(gè)或兩個(gè)以）是指兩個(gè)或兩個(gè)以上的蛋白質(zhì)分子通過(guò)上的蛋白質(zhì)分子通過(guò)非共價(jià)鍵非共價(jià)鍵形成蛋白形成蛋白質(zhì)復(fù)合體（質(zhì)復(fù)合體（ protein complex）的過(guò)程）的過(guò)程n分子機(jī)器分子機(jī)器n蛋白質(zhì)復(fù)合體是生命分子機(jī)器的核心結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)復(fù)合體是生命分子機(jī)器的核心結(jié)構(gòu)n蛋白質(zhì)復(fù)合體的形式蛋白質(zhì)復(fù)合體的形式 二聚體dimer 三聚體trimer 寡聚體oligomer 多聚體polymer 同聚體homopolymer 異聚體heteropolymern復(fù)合體的形

2、狀復(fù)合體的形狀n復(fù)合體的穩(wěn)定性復(fù)合體的穩(wěn)定性 n細(xì)胞內(nèi)環(huán)境有利用蛋白質(zhì)復(fù)合體的形成n體外PPI研究難以模擬細(xì)胞內(nèi)環(huán)境蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)（interactome）PPI的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)PPI 界面依靠非共價(jià)鍵維系n氫鍵氫鍵n范德華力范德華力n疏水力疏水力n離子鍵離子鍵n共價(jià)鍵共價(jià)鍵nPPI 界面大小影響穩(wěn)定性蛋白質(zhì)相互作用結(jié)構(gòu)域n結(jié)構(gòu)域是蛋白質(zhì)中折疊較為緊密且具有是蛋白質(zhì)中折疊較為緊密且具有一定功能的球狀和纖維狀的結(jié)構(gòu)，以模一定功能的球狀和纖維狀的結(jié)構(gòu)，以模塊方式具有多種不同功能的分子。塊方式具有多種不同功能的分子。n蛋白質(zhì)相互作用結(jié)構(gòu)域?qū)Ｖ改切┛梢宰R(shí)專(zhuān)指那些可以識(shí)別其他蛋白質(zhì)的特殊結(jié)構(gòu)，從而介導(dǎo)兩別其他蛋白

3、質(zhì)的特殊結(jié)構(gòu)，從而介導(dǎo)兩個(gè)蛋白之間發(fā)生相互作用的結(jié)構(gòu)域，一個(gè)蛋白之間發(fā)生相互作用的結(jié)構(gòu)域，一般由般由50-100個(gè)氨基酸組成。個(gè)氨基酸組成。n結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)域相互作用結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)域相互作用n結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)域-肽段模體相互作用肽段模體相互作用SH2結(jié)構(gòu)域n約100個(gè)氨基酸序列，識(shí)別磷酸化的酪氨酸及相鄰的3-6個(gè)氨基酸殘基。SH3結(jié)構(gòu)域n由50個(gè)氨基酸殘基組成，存在于各種蛋白激酶和銜接蛋白中，識(shí)別富含脯氨酸的序列R/KXXPXXP或PXXPXR/K，其親和力與脯氨酸殘基及相鄰氨基酸殘基組成相關(guān)。PH結(jié)構(gòu)域n100-120個(gè)氨基酸殘基組成，存在于多種細(xì)胞骨架蛋白，蛋白激酶、PLC超家族中。n兼具結(jié)合脂類(lèi)和蛋白

4、質(zhì)的能力，參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。WW結(jié)構(gòu)域n30-40個(gè)氨基酸殘基組成的三股反平行片層結(jié)構(gòu)域，含兩個(gè)高度保守的色氨酸WW而得名，識(shí)別富含脯氨酸的序列XPPXY，參與非受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和蛋白質(zhì)降解等過(guò)程。PDZ結(jié)構(gòu)域n由80-100個(gè)氨基酸殘基組成，包含2個(gè)-螺旋和6個(gè)-折疊，常以串聯(lián)重復(fù)拷貝存在，是構(gòu)成支架蛋白的重要結(jié)構(gòu)，在細(xì)胞膜蛋白質(zhì)的聚集中發(fā)揮重要作用。蛋白質(zhì)相互作用結(jié)構(gòu)域識(shí)別蛋白質(zhì)的翻譯后修飾nSH2結(jié)構(gòu)域識(shí)別含磷酸化酪氨酸模體結(jié)構(gòu)域識(shí)別含磷酸化酪氨酸模體nFHA結(jié)構(gòu)域和結(jié)構(gòu)域和MH2結(jié)構(gòu)域識(shí)別含磷酸化結(jié)構(gòu)域識(shí)別含磷酸化絲氨酸絲氨酸/蘇氨酸模體蘇氨酸模體nBromo結(jié)構(gòu)域識(shí)別組蛋白中的

5、乙酰化賴結(jié)構(gòu)域識(shí)別組蛋白中的乙?；嚢彼岚彼醤Chromo結(jié)構(gòu)域識(shí)別組蛋白中的甲基化結(jié)構(gòu)域識(shí)別組蛋白中的甲基化賴氨酸賴氨酸銜接蛋白和支架蛋白是蛋白質(zhì)復(fù)合體銜接蛋白和支架蛋白是蛋白質(zhì)復(fù)合體的接頭和骨架的接頭和骨架nAdaptor proteinnGRB2(growth factor receptor-binding protein2) SH3-SH2-SH3nNCK(noncatalytic region of tyrosine kinase) SH3-SH3-SH3-SH2nScaffold proteinnJIP-1(JNK-interacting protein1)PPI 研究的醫(yī)學(xué)意義n

6、PPIPPI異?？蓪?dǎo)致細(xì)胞活動(dòng)失控異?？蓪?dǎo)致細(xì)胞活動(dòng)失控n相互作用能力的喪失可喪失原有的正常調(diào)節(jié)。相互作用能力的喪失可喪失原有的正常調(diào)節(jié)。n突變也可產(chǎn)生新的相互作用。突變也可產(chǎn)生新的相互作用。n抑制抑制PPIPPIn設(shè)計(jì)小分子和多肽抑制劑，特異性結(jié)合于設(shè)計(jì)小分子和多肽抑制劑，特異性結(jié)合于PPIPPI的界面，的界面，阻斷阻斷PPIPPI。馬拉維諾馬拉維諾 赫賽汀赫賽汀n增強(qiáng)增強(qiáng)PPI PPI P53 MDM2P53 MDM2PPI 研究策略n蛋白質(zhì)復(fù)合物空間結(jié)構(gòu)的精細(xì)解析蛋白質(zhì)復(fù)合物空間結(jié)構(gòu)的精細(xì)解析n X射線晶體衍射射線晶體衍射n核磁共振波譜核磁共振波譜n三維電鏡重構(gòu)技術(shù)三維電鏡重構(gòu)技術(shù)nPP

7、I的高通量研究的高通量研究n酵母雙雜交酵母雙雜交n親和純化聯(lián)合質(zhì)譜技術(shù)親和純化聯(lián)合質(zhì)譜技術(shù)蛋白質(zhì)相互作用的類(lèi)型蛋白質(zhì)相互作用的類(lèi)型n蛋白質(zhì)相互作用的類(lèi)型：蛋白質(zhì)相互作用的類(lèi)型：牢固型牢固型互作和互作和暫時(shí)型暫時(shí)型互作兩互作兩種?；プ髁瓤梢詮?qiáng)，也可以弱。種?；プ髁瓤梢詮?qiáng)，也可以弱。n牢固型互作：以多亞基蛋白復(fù)合體常見(jiàn)，可以通過(guò)牢固型互作：以多亞基蛋白復(fù)合體常見(jiàn)，可以通過(guò)免免疫共沉淀、疫共沉淀、Pull-down法法研究。研究。n暫時(shí)型互作：涉及到胞內(nèi)大部分生物過(guò)程，包括蛋白暫時(shí)型互作：涉及到胞內(nèi)大部分生物過(guò)程，包括蛋白折疊、修飾、轉(zhuǎn)運(yùn)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞周期等。折疊、修飾、轉(zhuǎn)運(yùn)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞周

8、期等。研究技術(shù)研究技術(shù)n酵母雙雜交篩選系統(tǒng)酵母雙雜交篩選系統(tǒng)n蛋白質(zhì)親和色譜蛋白質(zhì)親和色譜 nPull-down Pull-down 技術(shù)技術(shù)n免疫共沉淀免疫共沉淀n細(xì)胞免疫熒光染色細(xì)胞免疫熒光染色n熒光共振能量轉(zhuǎn)移（熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRETFRET）n表面等離子共振表面等離子共振( (一一) ) 酵母雙雜交技術(shù)酵母雙雜交技術(shù)n一種基因篩選策略：蛋白質(zhì)之間微弱的、瞬間的一種基因篩選策略：蛋白質(zhì)之間微弱的、瞬間的作用也能夠通過(guò)報(bào)告基因的表達(dá)產(chǎn)物敏感地檢測(cè)作用也能夠通過(guò)報(bào)告基因的表達(dá)產(chǎn)物敏感地檢測(cè)得到得到 。n酵母雙雜交系統(tǒng)利用雜交基因通過(guò)激活酵母雙雜交系統(tǒng)利用雜交基因通過(guò)激活報(bào)告基因報(bào)告基因的

9、表達(dá)探測(cè)蛋白蛋白的相互作用。的表達(dá)探測(cè)蛋白蛋白的相互作用。n用于活細(xì)胞體內(nèi)的蛋白質(zhì)之間的相互作用研究。用于活細(xì)胞體內(nèi)的蛋白質(zhì)之間的相互作用研究。n簡(jiǎn)便、快速地分離到新的互作蛋白。簡(jiǎn)便、快速地分離到新的互作蛋白。原原 理理n原理基于真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)特殊性，這些轉(zhuǎn)原理基于真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)特殊性，這些轉(zhuǎn)錄因子通常需要兩個(gè)或以上相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域組成。錄因子通常需要兩個(gè)或以上相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域組成。分別使結(jié)合域和激活域同分別使結(jié)合域和激活域同誘餌蛋白誘餌蛋白和和獵物蛋白獵物蛋白形成形成融合蛋白，在酵母細(xì)胞中表達(dá)，如果兩種蛋白可以融合蛋白，在酵母細(xì)胞中表達(dá)，如果兩種蛋白可以發(fā)生相互作用，則可使結(jié)

10、合域和激活域在空間上充發(fā)生相互作用，則可使結(jié)合域和激活域在空間上充分接近，從而激活報(bào)告基因。分接近，從而激活報(bào)告基因。n酵母的轉(zhuǎn)錄因子酵母的轉(zhuǎn)錄因子GAL4 GAL4由功能上由功能上相互獨(dú)立的結(jié)相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域構(gòu)域構(gòu)成，構(gòu)成，DNA結(jié)合結(jié)合功能域功能域(DNA binding domain，DBD)和和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（activation domain，AD）。只有當(dāng)被分開(kāi)的兩者通過(guò)適當(dāng)?shù)耐緩皆诳臻g）。只有當(dāng)被分開(kāi)的兩者通過(guò)適當(dāng)?shù)耐緩皆诳臻g上較為接近時(shí)，才能重新呈現(xiàn)完整的上較為接近時(shí)，才能重新呈現(xiàn)完整的GAL4轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄因子活性，使啟動(dòng)子下游基因得到轉(zhuǎn)錄?；钚裕箚?dòng)子下游基因

11、得到轉(zhuǎn)錄。酵母雙雜交酵母雙雜交 優(yōu)優(yōu) 點(diǎn)點(diǎn)1. 作用信號(hào)是在融合基因表達(dá)后，作用信號(hào)是在融合基因表達(dá)后， 在細(xì)胞內(nèi)重建轉(zhuǎn)錄因在細(xì)胞內(nèi)重建轉(zhuǎn)錄因 子的作用而給出的，子的作用而給出的， 省去了純化蛋白質(zhì)的繁瑣步驟。省去了純化蛋白質(zhì)的繁瑣步驟。 2. 檢測(cè)在活細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行，檢測(cè)在活細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行， 可以在一定程度上代表細(xì)胞內(nèi)可以在一定程度上代表細(xì)胞內(nèi) 的真實(shí)情況。的真實(shí)情況。 3. 檢測(cè)的結(jié)果可以是基因表達(dá)產(chǎn)物的積累效應(yīng)，檢測(cè)的結(jié)果可以是基因表達(dá)產(chǎn)物的積累效應(yīng)， 因而可因而可 檢測(cè)存在于蛋白質(zhì)之間的微弱的或暫時(shí)的相互作用。檢測(cè)存在于蛋白質(zhì)之間的微弱的或暫時(shí)的相互作用。 4. 酵母雙雜交系統(tǒng)可采用不同組織、

12、器官、細(xì)胞類(lèi)型和酵母雙雜交系統(tǒng)可采用不同組織、器官、細(xì)胞類(lèi)型和 分化時(shí)期材料構(gòu)建分化時(shí)期材料構(gòu)建cDNA文庫(kù)，文庫(kù)， 能分析細(xì)胞漿、細(xì)胞能分析細(xì)胞漿、細(xì)胞 核及膜結(jié)合蛋白等多種不同亞細(xì)胞部位及功能的蛋白。核及膜結(jié)合蛋白等多種不同亞細(xì)胞部位及功能的蛋白。 缺點(diǎn)缺點(diǎn)n 自身有轉(zhuǎn)錄功能的蛋白會(huì)造成假陽(yáng)性。融合自身有轉(zhuǎn)錄功能的蛋白會(huì)造成假陽(yáng)性。融合蛋白會(huì)影響蛋白的真實(shí)結(jié)構(gòu)和功能。不利于核蛋白會(huì)影響蛋白的真實(shí)結(jié)構(gòu)和功能。不利于核外蛋白研究，會(huì)導(dǎo)致假陰性外蛋白研究，會(huì)導(dǎo)致假陰性 。n利用酵母雙雜交發(fā)現(xiàn)新的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)的新功能利用酵母雙雜交發(fā)現(xiàn)新的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)的新功能n在細(xì)胞體內(nèi)研究抗原和抗體的相互作用

13、在細(xì)胞體內(nèi)研究抗原和抗體的相互作用n利用酵母雙雜交篩選藥物的作用位點(diǎn)以及藥物對(duì)蛋利用酵母雙雜交篩選藥物的作用位點(diǎn)以及藥物對(duì)蛋白質(zhì)之間相互作用的影響白質(zhì)之間相互作用的影響n利用酵母雙雜交建立基因組蛋白連鎖圖利用酵母雙雜交建立基因組蛋白連鎖圖 （Genome Protein Linkage Map） 應(yīng)應(yīng) 用用n2005年年9月月1日出版的電子版日出版的電子版Cell上，德國(guó)上，德國(guó)科學(xué)家采用了科學(xué)家采用了4456個(gè)誘餌蛋白和個(gè)誘餌蛋白和5632個(gè)個(gè)獵物蛋白，采用獵物蛋白，采用 酵母雙雜交方法進(jìn)行研究。酵母雙雜交方法進(jìn)行研究。結(jié)果，在結(jié)果，在1705種蛋白質(zhì)間之間確定了種蛋白質(zhì)間之間確定了3186

14、種新的相互作用關(guān)系。同時(shí)采用免疫種新的相互作用關(guān)系。同時(shí)采用免疫共沉淀和共沉淀和Pull-down驗(yàn)證了這一結(jié)果。再驗(yàn)證了這一結(jié)果。再通過(guò)拓?fù)鋵W(xué)等評(píng)價(jià)，至少在通過(guò)拓?fù)鋵W(xué)等評(píng)價(jià)，至少在401種蛋白質(zhì)種蛋白質(zhì)間有間有911種相互作用聯(lián)系。種相互作用聯(lián)系。蛋白質(zhì)親和色譜蛋白質(zhì)親和色譜 n 基本原理是將一種蛋白質(zhì)固定于某種基質(zhì)上（如Sepharose），當(dāng)細(xì)胞抽提液經(jīng)過(guò)改基質(zhì)時(shí)，可與該固定蛋白相互作用的配體蛋白被吸附，而沒(méi)有吸附的非目標(biāo)蛋白則隨洗脫液流出。被吸附的蛋白可以通過(guò)改變洗脫液或者洗脫條件而回收下來(lái)。 應(yīng)用應(yīng)用n被用于蛋白質(zhì)復(fù)合體的大規(guī)模篩選被用于蛋白質(zhì)復(fù)合體的大規(guī)模篩選n與化學(xué)交聯(lián)法聯(lián)合可以

15、提高篩選效率與化學(xué)交聯(lián)法聯(lián)合可以提高篩選效率n與酵母雙雜交聯(lián)合為探討與酵母雙雜交聯(lián)合為探討PPI的動(dòng)態(tài)特性提供的動(dòng)態(tài)特性提供有意義的信息有意義的信息Pull-Down技術(shù)技術(shù)n 目的：目的： 1. 用固相化的、已標(biāo)記的餌蛋白或標(biāo)簽蛋白（生物素用固相化的、已標(biāo)記的餌蛋白或標(biāo)簽蛋白（生物素- 、 PolyHis-或或GST-），從細(xì)胞裂解液中釣出與之互作的），從細(xì)胞裂解液中釣出與之互作的 蛋白。蛋白。 2. 確定已知的餌蛋白與釣出蛋白或已純化的相關(guān)蛋白間確定已知的餌蛋白與釣出蛋白或已純化的相關(guān)蛋白間 的相互作用關(guān)系。的相互作用關(guān)系。 3. 從體外轉(zhuǎn)錄或翻譯體系中檢測(cè)出蛋白相互作用。從體外轉(zhuǎn)錄或翻譯

16、體系中檢測(cè)出蛋白相互作用。 優(yōu)優(yōu) 點(diǎn)點(diǎn) 1. 用普通的試驗(yàn)儀器和試劑（如離心機(jī)、用普通的試驗(yàn)儀器和試劑（如離心機(jī)、 Mini-Gel、蛋白染色）、蛋白染色） 2. 靈活的靈活的Pull-Down模式，鹽離子、變性劑濃模式，鹽離子、變性劑濃 度可調(diào)，對(duì)于弱蛋白相互作用也適用。度可調(diào)，對(duì)于弱蛋白相互作用也適用。 3. 一天之內(nèi)一天之內(nèi)“Pull Down”和檢測(cè)可能與餌蛋白和檢測(cè)可能與餌蛋白 相結(jié)合的蛋白。相結(jié)合的蛋白。 4. 高效回收互作蛋白復(fù)合物。高效回收互作蛋白復(fù)合物。缺點(diǎn)缺點(diǎn)n表位附加標(biāo)記可能會(huì)使融合蛋白不穩(wěn)定，改變表位附加標(biāo)記可能會(huì)使融合蛋白不穩(wěn)定，改變或或使融合蛋白功能喪失使融合蛋白功

17、能喪失。n出現(xiàn)假陽(yáng)性出現(xiàn)假陽(yáng)性。實(shí)驗(yàn)所檢測(cè)到的相互作用可能。實(shí)驗(yàn)所檢測(cè)到的相互作用可能時(shí)由蛋白質(zhì)所帶電荷引起的，并不是生理性的時(shí)由蛋白質(zhì)所帶電荷引起的，并不是生理性的相互作用；蛋白的相互作用可能并不是直接的，相互作用；蛋白的相互作用可能并不是直接的，可是由第三者作為中介的；有時(shí)會(huì)檢測(cè)到兩種可是由第三者作為中介的；有時(shí)會(huì)檢測(cè)到兩種在細(xì)胞中不可能相遇卻有極強(qiáng)親和力的蛋白。在細(xì)胞中不可能相遇卻有極強(qiáng)親和力的蛋白。因此實(shí)驗(yàn)結(jié)果還應(yīng)經(jīng)其他方法驗(yàn)證因此實(shí)驗(yàn)結(jié)果還應(yīng)經(jīng)其他方法驗(yàn)證。 免疫共沉淀（co-immunoprecipitation）n免疫共沉淀（免疫共沉淀（co-IP）是以抗體和抗原之間的是以抗體和

18、抗原之間的特異性結(jié)合為基礎(chǔ)，確定兩種蛋白質(zhì)在完整的特異性結(jié)合為基礎(chǔ)，確定兩種蛋白質(zhì)在完整的細(xì)胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。細(xì)胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。n優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)是蛋白處于天然狀態(tài)，蛋白的相互作用可是蛋白處于天然狀態(tài)，蛋白的相互作用可以在天然狀態(tài)下進(jìn)行，可以避免認(rèn)為影響；可以在天然狀態(tài)下進(jìn)行，可以避免認(rèn)為影響；可以分離得到天然狀態(tài)下相互作用的蛋白復(fù)合以分離得到天然狀態(tài)下相互作用的蛋白復(fù)合體。體。 n缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：免疫共沉淀同樣不能保證沉淀的蛋白復(fù)免疫共沉淀同樣不能保證沉淀的蛋白復(fù)合物時(shí)候?yàn)橹苯酉嗷プ饔玫膬煞N蛋白。另外靈合物時(shí)候?yàn)橹苯酉嗷プ饔玫膬煞N蛋白。另外靈敏度不如親和色譜高。敏度不如親和色譜

19、高。 Co-Immunoprecipitation(WesternBlotorMS)HBc-YFPpEYFPFLAG-MxA WTFLAG-MxA L612KFLAG-MxA K83A Anti-GFP-IPIPIP4% input4% input FLAG-MxAFLAG-MxAHBc-YFPHBc-YFPYFP細(xì)胞免疫熒光染色細(xì)胞免疫熒光染色n利用不同熒光基團(tuán)標(biāo)記的抗體與細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)蛋利用不同熒光基團(tuán)標(biāo)記的抗體與細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)蛋白的結(jié)合，借助激光共聚焦顯微鏡獲取熒光圖白的結(jié)合，借助激光共聚焦顯微鏡獲取熒光圖像，若不同的蛋白的熒光圖像有像，若不同的蛋白的熒光圖像有共定位共定位（co-co-loca

20、lizationlocalization），則可提供這些蛋白有相互作），則可提供這些蛋白有相互作用的可能性。用的可能性。n共定位不一定有相互作用，可能是間接相互作共定位不一定有相互作用，可能是間接相互作用用。MxA colocalizes with HBcAg ACFP-MxAHBcAgMergedHBcAgCFP-K83AHBcAgCFP-L612KMergedMergedLi N et al. Hepatology. 2012 BYFP-HBcAgMergedCFP-MxAYFP-HBcAgMergedCFP-K83ACFP-L612KYFP-HBcAgMerged熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)熒光

21、共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)(Fluorescence resonance energy transfer) FRET 原理：原理： 兩種熒光蛋白兩種熒光蛋白CFP和和 YFP，CFP的的發(fā)射光譜發(fā)射光譜與與YFP的的吸收光譜吸收光譜有相當(dāng)?shù)闹丿B有相當(dāng)?shù)闹丿B, 當(dāng)它們足夠接近當(dāng)它們足夠接近時(shí)時(shí), 用用CFP的吸收波長(zhǎng)激發(fā)的吸收波長(zhǎng)激發(fā), CFP的發(fā)色基團(tuán)將會(huì)的發(fā)色基團(tuán)將會(huì)把能量高效率地共振轉(zhuǎn)移至把能量高效率地共振轉(zhuǎn)移至YFP的發(fā)色基團(tuán)上的發(fā)色基團(tuán)上,所以所以CFP的發(fā)射熒光將減弱或消失的發(fā)射熒光將減弱或消失, 主要發(fā)射將主要發(fā)射將是是YFP的熒光。兩個(gè)發(fā)色基團(tuán)之間的能量的熒光。兩個(gè)發(fā)色基團(tuán)之間的能量轉(zhuǎn)換效

22、轉(zhuǎn)換效率率與它們之間的與它們之間的空間距離的空間距離的6次方成反比次方成反比, 對(duì)空間對(duì)空間位置的改變非常靈敏。位置的改變非常靈敏。 The donor emission spectrum must significantly overlap the excitation spectrum of the acceptor 供體發(fā)射波與受體供體發(fā)射波與受體激發(fā)波有重疊激發(fā)波有重疊 The donor and acceptor fluorophores must be in favorable mutual orientation 合適的空間取向合適的空間取向 The distance betwe

23、en the donor and acceptor fluorophores must be less than 100 距離距離100 FRET: basic requirementsDetecting methods Monitor changes in donor fluorescence 檢測(cè)供體檢測(cè)供體熒光熒光 Monitor changes in acceptor fluorescence 檢測(cè)受檢測(cè)受體熒光體熒光 Simultaneously measure changes in both donor and acceptor fluorescence using spectra

24、l imaging 同時(shí)檢測(cè)受體和供體熒光同時(shí)檢測(cè)受體和供體熒光100 Ex=452 nm Em=527 nm Em=475 nm熒光共振能量轉(zhuǎn)移熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)技術(shù)驗(yàn)證蛋技術(shù)驗(yàn)證蛋白質(zhì)之間的相互作用白質(zhì)之間的相互作用TransferExcitationEmission 要研究?jī)煞N蛋白質(zhì)要研究?jī)煞N蛋白質(zhì)a和和b間的相互作用間的相互作用,可以根據(jù)可以根據(jù)FRET 原理構(gòu)建一融合蛋白，這種融合蛋白由三部分組成原理構(gòu)建一融合蛋白，這種融合蛋白由三部分組成: CFP, 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)b， YFP。 用用CFP吸收波長(zhǎng)吸收波長(zhǎng)452 nm作為激發(fā)波長(zhǎng)作為激發(fā)波長(zhǎng), 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)a與與b沒(méi)有

25、發(fā)生相互作用時(shí)沒(méi)有發(fā)生相互作用時(shí), CFP與與YFP相距很遠(yuǎn)相距很遠(yuǎn) 不能發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移不能發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移,因而檢測(cè)到的是發(fā)射波長(zhǎng)因而檢測(cè)到的是發(fā)射波長(zhǎng) 476 nm的的CFP熒光熒光;但當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)但當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)a與與b發(fā)生相互作用時(shí)發(fā)生相互作用時(shí),由由 于蛋白質(zhì)于蛋白質(zhì)b受蛋白質(zhì)受蛋白質(zhì)a作用而發(fā)生構(gòu)象變化作用而發(fā)生構(gòu)象變化,使使CFP與與YFP 充分靠近發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，此時(shí)檢測(cè)到的就是發(fā)充分靠近發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，此時(shí)檢測(cè)到的就是發(fā) 射波長(zhǎng)為射波長(zhǎng)為527 nm的的YFP熒光。將編碼這種融合蛋白的基熒光。將編碼這種融合蛋白的基 因通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)使其在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，這樣就可以在活

26、細(xì)因通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)使其在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，這樣就可以在活細(xì) 胞生理?xiàng)l件下研究蛋白質(zhì)胞生理?xiàng)l件下研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間的相互作用。蛋白質(zhì)間的相互作用。PhotobleachingPhotobleaching: an example應(yīng)用實(shí)例應(yīng)用實(shí)例1、關(guān)于細(xì)胞凋亡的研究、關(guān)于細(xì)胞凋亡的研究Reiko等利用等利用FRET技術(shù)研究了技術(shù)研究了Caspase8與與Bid蛋白之間的相互作用蛋白之間的相互作用, 研究者將研究者將Bid蛋白兩端分別與蛋白兩端分別與CFP與與YFP融合，精心設(shè)計(jì)使其在沒(méi)有被融合，精心設(shè)計(jì)使其在沒(méi)有被裂解前剛好可以發(fā)生裂解前剛好可以發(fā)生FRET ，當(dāng)，當(dāng)Bid蛋白被裂解后蛋白被裂解后FR

27、ET效應(yīng)自然消效應(yīng)自然消失，這是一種很好的檢測(cè)失，這是一種很好的檢測(cè)Caspase8 酶活性方法，而且當(dāng)酶活性方法，而且當(dāng)Bid蛋白與蛋白與CFP與與YFP融合之后仍能行使正常的功能，當(dāng)融合物在細(xì)胞內(nèi)被裂解融合之后仍能行使正常的功能，當(dāng)融合物在細(xì)胞內(nèi)被裂解后，連接后，連接CFP的片段轉(zhuǎn)移到線粒體，通過(guò)的片段轉(zhuǎn)移到線粒體，通過(guò)CFP熒光可以很清楚地觀測(cè)熒光可以很清楚地觀測(cè)到其在細(xì)胞內(nèi)的定位。到其在細(xì)胞內(nèi)的定位。 2. 關(guān)于膜蛋白的研究關(guān)于膜蛋白的研究 細(xì)胞膜受體之間相互作用細(xì)胞膜受體之間相互作用: 外界外界刺激因素向細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳遞一般認(rèn)為通過(guò)其在胞膜上的刺激因素向細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳遞一般認(rèn)為通過(guò)其

28、在胞膜上的受體受體,當(dāng)配體與受體結(jié)合后當(dāng)配體與受體結(jié)合后,引起受體構(gòu)象變化或化學(xué)修飾，引起受體構(gòu)象變化或化學(xué)修飾，介導(dǎo)信號(hào)傳遞。但是關(guān)于介導(dǎo)信號(hào)傳遞。但是關(guān)于Fas及其同源物及其同源物TNFR(均為胞膜均為胞膜上的三聚體受體上的三聚體受體)的研究發(fā)現(xiàn)的研究發(fā)現(xiàn),它們都可以在無(wú)配體存在的情它們都可以在無(wú)配體存在的情況下自發(fā)組裝況下自發(fā)組裝,并介導(dǎo)信號(hào)傳遞并介導(dǎo)信號(hào)傳遞,引發(fā)細(xì)胞凋亡。其中在鑒定引發(fā)細(xì)胞凋亡。其中在鑒定Fas發(fā)生三聚體化的實(shí)驗(yàn)中使用了發(fā)生三聚體化的實(shí)驗(yàn)中使用了FRET技術(shù)技術(shù), 將將Fas分別與分別與CFP和和YFP融合融合,利用此項(xiàng)技術(shù)可以很方便地觀測(cè)到利用此項(xiàng)技術(shù)可以很方便地觀

29、測(cè)到Fas單體單體是否發(fā)生聚合。是否發(fā)生聚合。n優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：免疫共沉淀、免疫共沉淀、pull-down等技術(shù)需要破等技術(shù)需要破碎細(xì)胞，只能反映細(xì)胞群體的靜態(tài)事件，碎細(xì)胞，只能反映細(xì)胞群體的靜態(tài)事件，F(xiàn)RET實(shí)現(xiàn)了單個(gè)活細(xì)胞實(shí)現(xiàn)了單個(gè)活細(xì)胞PPI在體內(nèi)實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)在體內(nèi)實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)的連續(xù)觀測(cè)。的連續(xù)觀測(cè)。n缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：要求發(fā)色基團(tuán)的距離小于要求發(fā)色基團(tuán)的距離小于100埃。另外埃。另外設(shè)備昂貴，還需要融合蛋白標(biāo)記設(shè)備昂貴，還需要融合蛋白標(biāo)記。 表面等離子共振技術(shù)表面等離子共振技術(shù)surfaceplasmonresonancetechnology (SPR) n 該技術(shù)是將誘餌蛋白結(jié)合于葡聚糖表面，葡聚糖層

30、固該技術(shù)是將誘餌蛋白結(jié)合于葡聚糖表面，葡聚糖層固定于幾十納米厚的技術(shù)膜表面。當(dāng)有蛋白質(zhì)混合物經(jīng)定于幾十納米厚的技術(shù)膜表面。當(dāng)有蛋白質(zhì)混合物經(jīng)過(guò)時(shí)，如果有蛋白質(zhì)同過(guò)時(shí)，如果有蛋白質(zhì)同“誘餌誘餌”蛋白蛋白發(fā)生相互作用，發(fā)生相互作用，那么兩者的結(jié)合將使金屬膜表面的折射率上升，從而那么兩者的結(jié)合將使金屬膜表面的折射率上升，從而導(dǎo)致共振角度的改變。而共振角度的改變與該處的蛋導(dǎo)致共振角度的改變。而共振角度的改變與該處的蛋白質(zhì)濃度成線性關(guān)系，由此可以檢測(cè)蛋白質(zhì)之間的相白質(zhì)濃度成線性關(guān)系，由此可以檢測(cè)蛋白質(zhì)之間的相互作用。互作用。n優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：該技術(shù)不需要標(biāo)記物和染料，安全靈敏快速，：該技術(shù)不需要標(biāo)記物和染料，

31、安全靈敏快速，還可定量分析。還可定量分析。n缺點(diǎn)缺點(diǎn)：需要專(zhuān)門(mén)的等離子表面共振檢測(cè)儀器。：需要專(zhuān)門(mén)的等離子表面共振檢測(cè)儀器。 其他技術(shù)其他技術(shù)n交聯(lián)技術(shù)（交聯(lián)技術(shù)（crosscrosslinKinglinKing）n蛋白質(zhì)探針技術(shù)蛋白質(zhì)探針技術(shù)n噬菌體展示技術(shù)（噬菌體展示技術(shù)（Phage displayPhage display）n生物信息學(xué)的方法（生物信息學(xué)的方法（Docking 嵌合計(jì)算）嵌合計(jì)算） 預(yù)測(cè)預(yù)測(cè)PPIPPInPPIPPI的預(yù)測(cè)主要基于蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中已知的相的預(yù)測(cè)主要基于蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中已知的相互作用數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)互作用數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)PPIPPI結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)和識(shí)別序結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)和識(shí)別序列等信息，通過(guò)相應(yīng)算法，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)間是否列等信息，通過(guò)相應(yīng)算法，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)間是否存在相互作用。存在相互作用。nPDB (protein databank)nPQS (protein quaternary structure)