第三章RNA轉錄

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1、第三章 RNA轉錄(RNA transcription) 3.1. ?Basic concept 3.2. Trancription survey 3.3. Promoter in Eukaryotes and Prokaryotes 3.4. Transcription Termination 3.5. Pre-RNA processing in Eukaryotes 3.1.??? 基本概念（P64） Basic concept ● 基因表達的第一步 ● 以D. S. DNA中的一條單鏈作為轉錄的模板 某一基因只以一條單鏈DNA 為模板進

2、行轉錄（不對稱轉錄） ● 在依賴DNA的RNA聚合酶的作用下 ● 按A U，C G 配對的原則，合成RNA分子 ● 模板單鏈 DNA的極性方向為3’ → 5’, 而非模板單鏈 DNA的極性方向與RNA鏈相同，均為5’ → 3’. DNA 3’----TACTCAT----5’ RNA 5’----AUGAGUA----3’ 5’----AUGAGUA----3’ （教材P64——圖3-1） 5’---ATGAGTA----3’ Non-template (sense strand) template (an

3、tisense strand) ● RNA的轉錄包括promotion, elongation, termination 三個階段 ● 從啟動子（promoter）到終止子（terminator）的DNA 序列稱為轉錄單位 （transcriptional unit） ● 原核生物中的轉錄單位多為 polycistron in operon 真核生物中的轉錄單位多為monocistron, No operon ● 轉錄原點記為+1，其上游記為負值，下游記為正值 ● RNA的主要種類及功能：mRNA——攜帶編碼多肽的遺傳信息

4、 tRNA——將核苷酸信息轉化為aa信息 轉運aa進入核糖體 rRNA——參與多肽合成 3.2.RNA轉錄概況 3.2.1轉錄的基本過程 1. 模板識別：RNApol與啟動子相互識別并結合的過程 （形成封閉的二元復合物） ? 啟動子（promoter）：DNA分子上結合RNApol并形成轉錄起始復合物的區(qū)域，通常也包括促進這一過程的調節(jié)蛋白結合位點rich A/T，易發(fā)生DNA呼吸現(xiàn)象形成單鏈區(qū) 2轉錄起始：啟動子區(qū)解

5、鏈，轉錄起始 （封閉的二元復合物 開放的二元復合物 三元復合物） 通常在這一過程中RNApol移動較慢，且易發(fā)生脫落——流產式起始 ——決定啟動子的強弱 3延伸： 延伸過程中的延宕現(xiàn)象（Eukaryotes）：Euk genome G/C分布不均勻 σ脫離全酶（Pro）/RNApol脫離轉錄起始復合物（Euk） 4終止：在終止子（terminator）處停止轉錄 3.2.2 RNApolymerase 1 RNA polymerase in Prokaryotes（以E.coli為例） 1）構成 ?

6、 核心酶(core enzyme)：2αββ’ ? 全酶（holoenzyme)2αββ’σ ? α： 核心酶組建因子/ 啟動子識別 ? β： RNA合成的活性中心 ? β’：與β共同構成活性中心 ? σ ：識別啟動子，增加酶與DNA的親和力 σ因子可減少RNApol與非啟動子DNA序列的親和力，而增加RNApol與啟動子的親和力，一旦轉錄起始， σ因子將脫離RNApol再次引導新的RNApol進行轉錄 ? ρ ：參與轉錄終止 2） Rifamycin（利福霉素）及Streptolydigin（利鏈菌素）對Pro轉錄的影響 Rif可結合β，阻止NTP的進入I位點

7、（Initiation site )（一旦形成三元復合物Rif不再起抑制作用）；利鏈菌素結合β的延伸位點(Elongation site)，抑制延伸。 ——β包含兩個活性中心：I位點（起始位點Initiation site） 專性結合ATP或GTP E位點（延伸位點 Elongation site ） 2 RNA polymerase in Eukaryotes ? RNApol的種類： 酶 細胞內定位

8、 轉錄產物 對α-鵝膏蕈堿的敏感性 RNApolⅠ 核仁 rRNA resistant RNApolⅡ 核質 mRNA /snRNA sensitive RNApolⅢ 核質 tRNA/snRNA(U6) species specificity

9、 Alu/5sRNA 注意：線粒體和葉綠體中的RNApol類似于Prokaryotes a -amanitin( α-鵝膏蕈堿) ? RNA polII 最大亞基含有特有的羧基末端結構域（carboxy-terminal domain CTD），是以7 amino acids（Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser)的一致序列為單元重復序列。CTD Rich serine or threonine ，易發(fā)生磷酸化而激活RNA polII 3.3. 啟動子（promoter） （P71，255） 3.3.1原核生物的啟動

10、子（ promoter in Prokaryotes） 現(xiàn)代基因的定義：合成一種蛋白質或RNA分子所需的全部DNA序列。——調控序列+編碼序列！ Promoter is a region of DNA involved in binding of RNA polymerase to initiate transcription.——cis-action site A cis-acting site controls the adjacent DNA but does not influence the other allele.（順式作用位點只控制鄰近DNA而不作用于其它等位序列）

11、 ? 啟動子的信息是由其本身的序列提供的，這類通過本身結構調節(jié)同一DNA分子上相鄰基因表達的DNA序列即cis-acting site（順式作用位點）。 ? trans-acting factor（反式作用因子）：通過產生相應的RNA或蛋白質產物調控基因的表達——eg σ因子。 1基本結構： ? Consensus sequence is an idealized sequence in which each position represents the base most often found when many actual sequences are compared. 1

12、）Sextama box（-35區(qū)）：RNApol識別位點（R 位點） T85 T83 G81 A61 C69 A52 2）Pribnow box（-10區(qū)）：RNApol結合位點（B 位點） T89 A89 T50 A65 A100T96 3）轉錄起始位點（initiator、I位點） CAT 轉錄起始的第一個核苷酸90%是Pu（A/G），G﹥A +1 E.coli 的CAT法則 2 影響轉錄起始的因素 1）Sextama box與Pribnow box的距

13、離：17bp最適 2） Sextama box與Pribnow box的序列 eg: Pribnow box——TATAAT 發(fā)生突變成為TACAAT 啟動效率下降（down mutation 下降突變） 3.3.2真核生物的啟動子（ promoter in Eukaryotes） ——是許多相應得轉錄因子與啟動子的元件結合后再使RNApol與啟動子結合起始轉錄的。 1.RNApolⅠ:啟動子分為兩部分——遠啟動子區(qū)（決定轉錄頻率）；近啟動子區(qū)（決定轉錄的精確起點） 2 . RNApolⅢ:內部啟動子（位于編碼序列內部），eg：Alu序列 3 . RNA

14、polⅡ:核基因的轉錄 1）轉錄起點：PyAPy（cap site）——Py2CAPy5 +1 2）TATA box：Hogness box TATA(A/T)A 類似于pribnow box -20~-30區(qū)（決定轉錄起點）少數(shù)基因沒有TATA box 3）遠上游啟動元件（UPE/UAS）——決定轉錄頻率，其走向不影響其功能 ? CAAT box：CCAAT -70~ -80 （類似于sextama box） ? GC box：GGGCGG -80~-110 ? Enhancer（增強子）:Enhancer element is

15、 a cis-acting sequence that increases the utilization of (some) eukaryotic promoters, and can function in either orientation and in any location (upstream or downstream) relative to the promoter.（真核生物中可提高鄰近啟動子利用率的順式作用序列，其功能不受位置（上游或下游）和距離的影響） Enhancer通過結合的蛋白質與Promoter相互靠近而增強啟動效率；Enhancer 和Promoter處于

16、不同DNA分子時也可以通過蛋白質的相互作用而增強轉錄效率。 Enhancer的作用特點： n 可增強轉錄起始效率（10~200倍甚至更高） n 增強作用與其所處位置和與靶位點（promoter）的距離無關 n 其序列構成為DR，核心序列（G）TGGA/TA/TA/T（G） n 其增強作用有組織特異性（需要特定的蛋白質因子才能起作用） n 其增強作用無基因專一性 3.4. Transcription Termination 3.4.1 終止子的種類 ——很難判斷所得到的是否為RNA終止轉錄區(qū)（研究終止子的難題之一） 1 Terminator is a sequence of

17、 DNA, represented at the end of the transcript, that causes RNA polymerase to terminate transcription. （終止子是為RNApol提供轉錄終止信號的一段DNA序列，需要經過轉錄后形成莖環(huán)結構起作用） 2 種類：intrinsic terminators/Rho-dependent terminators （不依賴ρ 因子的終止子/依賴ρ 因子的終止子） 1） intrinsic terminators IR（莖環(huán)結構）區(qū)rich G/C 3’緊接著poly(U)結構—

18、—RNApol在terminator 處停頓 terminator與模板的結合力下降 2） Rho-dependent terminators IR（莖環(huán)結構）區(qū) G/C%減少 3’緊接著poly(U)結構減少或缺失 ρ因子：RNApol釋放因子，結合mRNA 5’并向3’移動，當RNApol在terminator 處停頓時，ρ因子趕上并終止轉錄。 具有NTPase活性 3 readthrough（通讀）與Polarity effect（極性效應） ? 通讀：RNApol在終止子處

19、不停止轉錄（ρ因子在RNApol停頓時無法及時趕上或其它抗終止因子的作用）的現(xiàn)象即readthrough——在翻譯過程中核糖體越過UGA/UAG/UAA繼續(xù)翻譯的現(xiàn)象也叫通讀 ? 極性效應：the effect of a mutation in one gene in influencing the expression (at transcription or translation) of subsequent genes in the same transcription unit. ——基因突變對同一轉錄單元的下游基因表達所產生的效應。 ? 極性效應發(fā)生的基礎 ——無義突變：

20、編碼aa的密碼子突變形成終止密碼。 ——原核生物轉錄和翻譯的同步進行 ? 極性效應的基本過程 ——正常情況下，核糖體從mRNA5’開始翻譯，阻礙ρ因子的移動，RNApol在依賴ρ因子的terminator處通讀。 ——無義突變后，核糖體提前終止翻譯， ρ因子得以迅速趕上RNApol，并在依賴ρ因子的terminator處終止。 3.4.2 抗終止作用（基因表達調控的手段）——作用方式 ? 破壞終止位點RNA的莖環(huán)結構——attenuater ——翻譯過程中核糖體在terminater處停頓破壞莖環(huán)結構 ——也是以原核生物轉錄和翻譯的同步進行為基礎的 ? 依賴蛋

21、白質因子的抗終止作用——λ phage 抗終止蛋白N、Q在早期基因轉錄終止處作用于RNApol并產生抗終止作用。 3.5. Pre-RNA processing in Eukaryotes 3.5.1 Pro/Euk mRNA的比較 1 Prokaryotes mRNA的特點 ? 半衰期短：易被降解 通常從5‘首先開始降解，有時其5’存在莖環(huán)結構對mRNA有保護作用 原核生物mRNA降解的兩個階段： n 核酸內切酶在5‘向3’移動的核糖體后切割 n 外切酶由3‘向5’外切 ? 通常是多順反子結構——polycistron mRNA 一般距離5‘較遠的編碼框翻譯

22、效率較差 ? mRNA不需要加工即可被翻譯 5‘-UTR的S-D序列（Shine-Dalgarna sequence)，是原核生物mRNA起始密碼子AUG上游7~12Nt出存在一段rich(Pu)（AGGAGG）的區(qū)域，能被核糖體小亞基16srRNA識別并結合，可提高翻譯效率。 2 Eukaryotes mRNA的特點 ? 半衰期長：不易被降解，受到一些因子的調控作用 eg: 酵母mRNA的降解： ? 外切酶去除poly(A) ? 去除5‘帽子 ? 5‘向3’的外切 ? 通常是單順反子結構——monocistron mRNA 也有例外：泛素基因、bifunctional

23、 mRNA（雙功能RNA） ? 需要加工：加帽/加尾/甲基化/剪接/編輯等 3.5.2 rRNA和tRNA的加工 1 rRNA基因的結構（中度重復基因） ? Eukaryotes:不同的rRNA串聯(lián)在一起（ 以Spacer間隔） ，形成重復單元 真核生物rRNA也存在intron，需要剪接。 ? Prokaryotes:rRNA和tRNA相間排列(以Spacer間隔)形成重復單元 2 tRNA基因的結構 ? Prokaryotes: tRNA與rRNA共同組成operon

24、 也存在其它operon that contain 7 tRNA genes separated by spacer sequences. ? Eukaryotes:與原核生物不同的是——真核生物3‘切除后無-CCA3’序列 ——某些真核生物tRNA存在14 nt intron Spacer和intron的差別？ Spacer（間隔子）是剪接過程中從完整編碼序列之間的切除的非編碼序列。 Intron（內含子）是剪接過程中從編碼序列內部切除的非編碼序列。 3 加工： ? RNase切除spacer RNase P是一種

25、包含有一分子RNA和一分子蛋白質的簡單RNP（ ribonucleoproteins ），其功能是參與tRNA的5‘的成熟 RNase P在原核和真核生物細胞中都存在，其RNA分子在進化中高度保守 RNase P的RNA 組分在體外(in vitro)可內切pre-tRNA ,是一種核酶(ribozyme) Ribozyme Definition: Ribozyme is a catalytic RNA molecules that catalyze particular biochemical reactions in the absence of protein. 能在缺失蛋白質的

26、情況下催化特異性生化反應的RNA分子.(核酶) Examples: The self-splicing of the large subunit of rRNA in Tetrahymena; ? nucleotide addition to the 5'- or 3'-end ? nucleotide modification on the base or the sugar moiety(P98) 3.5.3 Eukaryotes hnRNA的加工——heterogeneous nuclear RNA Processing Eukaryotes hnRNA加工的形式： hnR

27、NA——是RNApolII轉錄的原初產物，合成后迅速被相應的protein結合形成hnRNP。 ? 加帽：在RNApolII合成出hnRNA5’ 20~30 nt時即發(fā)生加帽 ——穩(wěn)定hnRNA，阻礙5‘外切核酸酶的外切（其它：翻譯、轉運等） hnRNA在鳥苷酸轉移酶的作用下與m7GTP作用形成5‘,5’-磷酸二酯鍵，然后帽子后的核苷酸糖基進一步發(fā)生甲基化。根據(jù)甲基化的情況分為Cap0（Cap0存在于單細胞真核生物mRNA中）, Cap1（Cap1 是各類真核生物mRNA的帽子的主要形式） and Cap2. ? 加尾：存在加尾信號，先切除3‘部分序列然后

28、加上poly(A) 　　　 ——穩(wěn)定hnRNA，防止３‘外切；利于轉運 　　　 ——利于cDNA的合成、mRNA的分離及其功能的研究 多數(shù)真核生物成熟mRNA都有3‘poly(A)的尾巴，這類mRNA記為poly(A)+；反之則為poly(A)-（ eg:Histone pre-mRNAs ） 加尾信號： 5’ Cap…..…..AAUAA..(20bases).CA………UUGUGUUG signal cleavage site Poly(A) addition site GUrich region

29、 加尾：首先CPSF 識別hnRNA加尾信號，Cf在下游發(fā)生切割，切除500~2000的nt，然后poly(A) polymerase (PAP，末端腺苷轉移酶)添加~200個A，PBP結合polyA。 ? 剪接： Ul, U2, U4, U5 和 U6 snRNA參與了hnRNA在核內的剪接，去除intron 1）intron的種類 內含子類型 細胞內定位

30、 GU-AG 細胞核，pre-mRNA(真核） AU-AC 細胞核，pre-mRNA(真核） I類內含子 細胞核， pre-rRNA (真核）, 細胞器RNA，少數(shù)細菌

31、 II類內含子 細胞器RNA，部分細菌 III類內含子 細胞器RNA 雙內含子 細胞器RNA tRNA前體內含子 細胞核，tRNA(真核） 2）GU-AG型內含子的剪接（ hnRNA剪接） Becau

32、se the intron defined in this way starts with the dinucleotide GT and ends with the dinucleotide AG, the junctions are often described as conforming to the GT-AG rule（ GT-AG 法則， Chambon法則） snRNA與hnRNA形成剪接體，參與剪接 3）I類內元的剪接 G因子參與的自剪接過程。 n I類內元：邊界為5′U-G 3 ′，存在中部核心序列（ Central core strucature ） n 鳥苷（

33、GMP、GDP、GTP）的核糖3‘-OH首先發(fā)動親核攻擊，打斷5’exon與intron5’的磷酸二酯鍵 n 游離的5端exon的3‘-OH再次攻擊3端的exon,并與其5’-P成二酯鍵。 n 實質：轉酯反應 4）II類內元的剪接 索套切除，由II類intron內部A的糖基2‘-OH攻擊5端exon Ⅱ類內含子的剪接 n 結構特點： 邊界序列為5‘↓GUGCG……YnAG↓； 有6個莖環(huán)結構； 有分支點順序（branch-point seguence） n 基本過程：無需鳥苷的輔助，但需鎂離子的存在。 分枝點A的2′-OH對5′端交界處的磷酸二酯鍵發(fā)動親核進攻，產生了套索（la

34、riat）結構（圖13-31）； 切下的外顯子1其3′-OH繼續(xù)對內含子3′端的交界序列進行親核進攻，同時釋放出套索狀的內含子。 5）內含子不一定是非編碼序列！I類II類的某些內含子中含有開放續(xù)框，可產生具有三種功能的蛋白。 n 核酸內切酶：在DNA的靶位點剪切，使內含子得以插入； n 反轉錄酶：涉及將內含子RNA變成DNA拷貝； n 成熟酶：從前體的RNA中切掉內含子的部分（使內含子的構象穩(wěn)定）。 這些蛋白可使內含子（或以其原來的DNA形式，或作為RNA的DNA拷貝）移動（mobile），使內含子可插到一個新的靶位點，這個現(xiàn)象叫做歸巢（homing） 6)多個內含子的剪接次序問

35、題 ——隨機剪接？同時發(fā)生？ 對于特定的前體RNA而言，內含子的剪接是按照特定的順序發(fā)生的！ 內含子的剪接取決于前體RNA分子的構象： u 首先由于特定的構象發(fā)生某一內含子的剪接； u 然后該中間體再次形成特定構象而剪接相應的內含子； u 依此類推完成全部內含子的剪接 ——剪接不一定從第一個內含子起始的！ 7）Alternative splicing（可變剪接） 50%的基因有這種剪接方式——部分的解釋為什么出現(xiàn)C-value paradox 剪接過程中選擇性的保留或去除hnRNA中的某些序列（可能是存在多個 polyA添加位點、或存在多個promoter位

36、點；也可能是exon或intron的選擇性保留） 8）trans splicing（反式剪接） 分子之間的一種剪接方式：不同分子的exon相互連接形成新的分子 ——比較少見！ ? 編輯：有些hnRNA剪接后 不能立刻用于翻譯，還要進行某些堿基的添加、刪除或替換——即RNA editing 包括：U的添加或刪除、 C 替換成 U 、A替換成G eg:神經細胞Gln受體蛋白A to G 載脂蛋白B 在小腸內第2153個密碼由CAA替換成了（第6666 位堿基），產物由512 kDa 變成241 kDa（胞嘧啶脫氨酶的作用） 纖毛蟲：

37、線粒體中cytochrome b gene與其cDNA比較發(fā)現(xiàn)其3‘位點添加了U——gRNA（guide RNA）的作用 U的添加和切除： n gRNA從3‘與pre-RNA配對 n 在不配對處有核酸內切酶切開RNA n TUTase或3‘U-exo添加或切除U，使pre-RNA與gRNA配對 遺傳學效應： n proofreading ；（校正） n translation regulation；（翻譯調節(jié)） n expanded genetic information.（擴充遺傳信息） ? 修飾 ： methylation（甲基化） 脊椎動物

38、體內通常mRNA A的N6發(fā)生甲基化（約有0.1%) 這些位點的甲基化很保守，但功能未知 3.1. ?Basic concept （轉錄的基本原則；轉錄復制的比較） 3.2. Trancription survey （轉錄的基本概況——過程、RNApol） 3.3. Promoter in Eukaryotes and Prokaryotes （promoter 結構，及各部分的作用；原、真核生物的比較） 3.4. Transcription Termination （終止子結構、種類；抗終止作用；極性效應等） 3.5. Pre-RNA processin

39、g in Eukaryotes （加工——rRNA 、tRNA 、hnRNA的加工；原、真核生物mRNA的比較） Question: 1 名詞：trans splicing 、alternative splicing、 enhancer、 terminator、 promoter、S-D sequence、read through、gRNA、RNA editing、Ribozyme 2 轉錄的基本過程，試比較生物體復制與轉錄的異同 3原核生物RNApol的基本構成及各亞基的功能 4真核生物RNApol 的種類及各自的轉錄產物 5原核生物一般的gene promoter結構特點及各部分的功能 6真核生物啟動子的種類與各自的結構 7終止子種類及異同；終止機制如何？ 8極性效應的產生機理 9真核生物、原核生物mRNA的異同 10真核生物hnRNA加工的種類 11RNA splicing的基本機理（三種）