細(xì)胞生物學(xué)教學(xué)課件第11章 細(xì)胞凋亡

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1、cell cell senescencesenescence機(jī)體結(jié)構(gòu)機(jī)體結(jié)構(gòu)細(xì)胞增殖細(xì)胞增殖細(xì)胞分化細(xì)胞分化細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)染色體染色體（DNADNA與蛋白質(zhì)的相互作用）與蛋白質(zhì)的相互作用）衰老衰老 機(jī)體的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和生理功能逐漸衰退的總現(xiàn)象機(jī)體的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和生理功能逐漸衰退的總現(xiàn)象稱為稱為衰老衰老(aging，senescence)。細(xì)胞衰老細(xì)胞衰老(cell senescence)是指細(xì)胞在正常環(huán)境條是指細(xì)胞在正常環(huán)境條件下發(fā)生的細(xì)胞生理功能和增殖能力減弱以及形態(tài)發(fā)件下發(fā)生的細(xì)胞生理功能和增殖能力減弱以及形態(tài)發(fā)生改變，并趨向死亡的現(xiàn)象。生改變，并趨向死亡的現(xiàn)象。3n

2、機(jī)體衰老并不等于所有細(xì)胞的衰機(jī)體衰老并不等于所有細(xì)胞的衰老，但機(jī)體的衰老是以細(xì)胞總體老，但機(jī)體的衰老是以細(xì)胞總體的衰老為基礎(chǔ)的。的衰老為基礎(chǔ)的。n社會(huì)老齡化與老年醫(yī)學(xué)社會(huì)老齡化與老年醫(yī)學(xué)(gerontology)。一般說(shuō)來(lái)能保持持續(xù)分裂能力的細(xì)胞不容易衰老；而分化程度高、又不分裂的細(xì)胞壽命卻是有限的，容易發(fā)生衰老和死亡。（一）體內(nèi)細(xì)胞存活的時(shí)間與細(xì)胞的種類有關(guān)接近或等于動(dòng)物自接近或等于動(dòng)物自身壽命的細(xì)胞身壽命的細(xì)胞緩慢更新（長(zhǎng)于緩慢更新（長(zhǎng)于3030天，短于動(dòng)物平均天，短于動(dòng)物平均壽命）的細(xì)胞壽命）的細(xì)胞快速更新（少于快速更新（少于3030天）的細(xì)胞天）的細(xì)胞神經(jīng)元神經(jīng)元脂肪細(xì)胞脂肪細(xì)胞肌細(xì)胞

3、肌細(xì)胞骨細(xì)胞骨細(xì)胞唾液腺細(xì)胞唾液腺細(xì)胞肝細(xì)胞肝細(xì)胞胰島細(xì)胞胰島細(xì)胞腎皮質(zhì)細(xì)胞腎皮質(zhì)細(xì)胞皮膚表皮細(xì)胞皮膚表皮細(xì)胞角膜上皮細(xì)胞角膜上皮細(xì)胞口腔細(xì)胞口腔細(xì)胞4（二）體外培養(yǎng)細(xì)胞分裂次數(shù)與衰老（二）體外培養(yǎng)細(xì)胞分裂次數(shù)與衰老58體外培養(yǎng)的二倍體細(xì)胞，細(xì)胞核隨著細(xì)胞分裂次數(shù)的增體外培養(yǎng)的二倍體細(xì)胞，細(xì)胞核隨著細(xì)胞分裂次數(shù)的增加不斷增大加不斷增大細(xì)胞核的核膜內(nèi)折（細(xì)胞核的核膜內(nèi)折（invagination）、）、染色質(zhì)固縮化染色質(zhì)固縮化 2009年度諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)授予三位美國(guó)科學(xué)家E.H.Blackburn、C.W.Greider和J.W.Szostak)，以表彰他們發(fā)現(xiàn)了端粒和端粒酶保護(hù)染色體的機(jī)

4、理。113GATTGATGATAGATAGATTTCTAACTACTATCUAUCUAAA53RNA Primer5GATTGATGATAGATAGATTTCTAACTACTAT533Shortened end512 細(xì)胞增殖次數(shù)與端粒細(xì)胞增殖次數(shù)與端粒DNA長(zhǎng)度有關(guān)。長(zhǎng)度有關(guān)。Harley等等1991發(fā)現(xiàn)體細(xì)胞染色體的端粒發(fā)現(xiàn)體細(xì)胞染色體的端粒DNA會(huì)隨細(xì)胞分會(huì)隨細(xì)胞分裂次數(shù)增加而不斷縮短，又稱裂次數(shù)增加而不斷縮短，又稱“有絲分裂鐘有絲分裂鐘”。細(xì)胞細(xì)胞DNA每復(fù)制一次端粒就縮短一段每復(fù)制一次端粒就縮短一段(5-20bp)，當(dāng)縮短到，當(dāng)縮短到Hayflick點(diǎn)時(shí)，會(huì)啟動(dòng)點(diǎn)時(shí)，會(huì)啟動(dòng)DNA損損

5、傷檢測(cè)點(diǎn)，激活傷檢測(cè)點(diǎn)，激活p53，引起，引起p21表達(dá)，導(dǎo)致不可逆表達(dá)，導(dǎo)致不可逆地退出細(xì)胞周期，走向衰亡。地退出細(xì)胞周期，走向衰亡。13 端粒的長(zhǎng)度與端粒酶端粒的長(zhǎng)度與端粒酶(telomerase)的活性的活性有關(guān)，在精原細(xì)胞、干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞有關(guān)，在精原細(xì)胞、干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞(如如Hela細(xì)胞細(xì)胞)中有較高的端粒酶活性，而正常中有較高的端粒酶活性，而正常體細(xì)胞中端粒酶的活性很低，呈抑制狀態(tài)。體細(xì)胞中端粒酶的活性很低，呈抑制狀態(tài)。端粒縮短能引起細(xì)胞衰老。端?？s短能引起細(xì)胞衰老。14細(xì)胞調(diào)亡細(xì)胞調(diào)亡的生物學(xué)意義生物學(xué)意義：一種生理保護(hù)機(jī)制，清除體內(nèi)多余、受損或危險(xiǎn)的細(xì)胞而一種生理保護(hù)機(jī)制，清

6、除體內(nèi)多余、受損或危險(xiǎn)的細(xì)胞而不對(duì)周圍的細(xì)胞或組織產(chǎn)生危害。在成熟的動(dòng)物個(gè)體中，不對(duì)周圍的細(xì)胞或組織產(chǎn)生危害。在成熟的動(dòng)物個(gè)體中，通過(guò)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞增殖速率的調(diào)節(jié)來(lái)維持組織器官細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞增殖速率的調(diào)節(jié)來(lái)維持組織器官細(xì)胞數(shù)量的穩(wěn)定。數(shù)量的穩(wěn)定。胸腺細(xì)胞正常凋亡1.1.細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞器的變化細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞器的變化 細(xì)胞連接及微絨毛消失，膜完整。細(xì)胞質(zhì)濃縮細(xì)胞連接及微絨毛消失，膜完整。細(xì)胞質(zhì)濃縮，線粒體增殖、空泡化，細(xì)胞膜反折包圍細(xì)胞內(nèi)的，線粒體增殖、空泡化，細(xì)胞膜反折包圍細(xì)胞內(nèi)的碎片，形成芽突。碎片，形成芽突。232.細(xì)胞核的變化 細(xì)胞核染色質(zhì)濃聚、固縮和裂解。細(xì)胞膜將細(xì)胞核染色質(zhì)濃聚、固

7、縮和裂解。細(xì)胞膜將細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的細(xì)胞器及染色質(zhì)的斷片分割包圍，形細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的細(xì)胞器及染色質(zhì)的斷片分割包圍，形成的多個(gè)膜結(jié)構(gòu)尚完整的泡狀小體，稱為凋亡小成的多個(gè)膜結(jié)構(gòu)尚完整的泡狀小體，稱為凋亡小體（體（apoptotic body）。）。左，正常胸腺細(xì)胞；右，凋亡胸腺細(xì)胞(凋亡小體)242526比較項(xiàng)目比較項(xiàng)目程序性細(xì)胞死亡程序性細(xì)胞死亡細(xì)胞壞死細(xì)胞壞死 染色質(zhì)DNA的降解是程序性細(xì)胞死亡的一個(gè)顯著特征。細(xì)胞染色質(zhì)DNA的特征性降解可作為細(xì)胞凋亡的一個(gè)重要的實(shí)驗(yàn)判斷依據(jù)。內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶基因的活化，染色質(zhì)DNA降解，染色質(zhì)DNA的斷片大小都為180200bp的整數(shù)倍，因而在電泳時(shí)，呈現(xiàn)特征性的DNA梯

8、狀條帶 (DNA ladders)。1DNA片斷化 29細(xì)胞色素c誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞DNA電泳圖1誘導(dǎo)0 h2誘導(dǎo)1 h3誘導(dǎo)2 h4誘導(dǎo)3 h5誘導(dǎo)4 h6陰性對(duì)照7Marker302.蛋白質(zhì)降解蛋白質(zhì)降解 切冬酶切冬酶(caspases)是一組存在于細(xì)胞溶膠中的結(jié)構(gòu)上相關(guān)的，能特異地?cái)嚅_(kāi)天冬氨酸殘基后的肽鍵，活性中心含半胱氨酸的蛋白酶，能分解細(xì)胞蛋白，起凋亡執(zhí)行器的作用。31三三 細(xì)胞凋亡的檢測(cè)細(xì)胞凋亡的檢測(cè)形態(tài)學(xué)觀測(cè)：染色法（臺(tái)盼蘭、DAPI）、透射和掃描電鏡觀察DNA電泳：DNA片段就呈現(xiàn)出梯狀條帶TUNEL測(cè)定法，即DNA斷裂的原位末端標(biāo)記法，對(duì)DNA分子斷裂缺口中的3-OH進(jìn)行原位標(biāo)記

9、。彗星電泳法（comet assay）流式細(xì)胞分析檢測(cè)細(xì)胞膜成分變化細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸翻轉(zhuǎn)至細(xì)胞膜外側(cè)四四 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的因子誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的因子物理性因子，包括射線（紫外線，物理性因子，包括射線（紫外線，射線等），射線等），較溫和的溫度刺激（如熱激，冷激）等較溫和的溫度刺激（如熱激，冷激）等化學(xué)及生物因子：包括活性氧基團(tuán)和分子，DNA 和蛋白質(zhì)合成的抑制劑，激素，細(xì)胞生長(zhǎng)因子，腫 瘤壞死因子（TNF），抗Fas/Apo-1/CD95抗體等Caspase的研究首先是在秀麗隱干線蟲(chóng)細(xì)胞的凋亡開(kāi)始的，從胚胎發(fā)育至的研究首先是在秀麗隱干線蟲(chóng)細(xì)胞的凋亡開(kāi)始的，從胚胎發(fā)育至成體，線蟲(chóng)共產(chǎn)生了成體，線

10、蟲(chóng)共產(chǎn)生了1090個(gè)體細(xì)胞，其中個(gè)體細(xì)胞，其中131個(gè)體細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)個(gè)體細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)ced3,ced4基因促進(jìn)細(xì)胞凋亡，基因促進(jìn)細(xì)胞凋亡，ced9基因阻止基因阻止ced3/ced4的激活，抑制的激活，抑制細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡。2002年美國(guó)麻省理工學(xué)院的年美國(guó)麻省理工學(xué)院的Robert horvitz,英國(guó)的英國(guó)的Sydney Brenner和和John E.Sulston因在線蟲(chóng)細(xì)胞凋亡方面的創(chuàng)新性研究共同獲得諾貝爾醫(yī)學(xué)和生理學(xué)因在線蟲(chóng)細(xì)胞凋亡方面的創(chuàng)新性研究共同獲得諾貝爾醫(yī)學(xué)和生理學(xué)獎(jiǎng)。獎(jiǎng)。Sydney Brenner H.Robert Horvitz John E.Sulsto

11、n細(xì)胞凋亡大致分為四個(gè)生化反應(yīng)階段。凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)階段。凋亡基因激活階段。細(xì)胞凋亡的執(zhí)行階段。凋亡細(xì)胞的消除階段。35（一）細(xì)胞凋亡的途徑與過(guò)程（一）細(xì)胞凋亡的途徑與過(guò)程 細(xì)胞凋亡發(fā)生過(guò)程的細(xì)胞凋亡發(fā)生過(guò)程的形態(tài)學(xué)階段形態(tài)學(xué)階段1.誘導(dǎo)凋亡期：誘導(dǎo)因素，信號(hào)傳導(dǎo)2.執(zhí)行期：?jiǎn)?dòng)凋亡，凋亡小體3.消亡期：被吞噬361.切冬酶切冬酶(caspases)：在蛋白質(zhì)水解酶級(jí)聯(lián)途徑中：在蛋白質(zhì)水解酶級(jí)聯(lián)途徑中具有專一性切割蛋白質(zhì)分子中的具有專一性切割蛋白質(zhì)分子中的Asp-X肽鍵肽鍵活性的活性的半半胱氨酸蛋白酶胱氨酸蛋白酶系。全稱為天冬氨酸特異性的半胱氨酸系。全稱為天冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白質(zhì)水解酶。又被

12、稱為蛋白質(zhì)水解酶。又被稱為胱冬肽酶胱冬肽酶（二）細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因和蛋白質(zhì)（二）細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因和蛋白質(zhì) 在哺乳類動(dòng)物細(xì)胞中caspase家族共有15個(gè)成員，又分為兩類：一類為執(zhí)行者(executioner或effector)，如caspase-3、6、7，可直接降解胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)蛋白和功能蛋白，引起凋亡；另一類為啟動(dòng)者(initiator)，如caspase-8、9，受到信號(hào)后，能通過(guò)自剪接而激活，然后引起caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，如caspase-8可依次激活caspase-3、6、7。38 Caspase通過(guò)切割底物發(fā)揮作用，如Caspase 激活的DNA酶在核小體間切割DNA，形成間隔20

13、0bp的DNA片段；執(zhí)行caspase切割核纖層蛋白，核纖層解聚，使細(xì)胞呈現(xiàn)出凋亡的形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)特征。DNA ladder392.2.抑癌基因在細(xì)胞凋亡中的作用抑癌基因在細(xì)胞凋亡中的作用 多數(shù)抑癌基因促進(jìn)細(xì)胞凋亡(p53基因等)。403.bcl-2基因基因 Bcl-2家族的特點(diǎn)是：家族的特點(diǎn)是：家族成員有的可誘導(dǎo)家族成員有的可誘導(dǎo)凋亡凋亡(Bax、bcl-xs、Bad、Bak、Bid、Bik)；有有的可阻止細(xì)胞凋亡的發(fā)生的可阻止細(xì)胞凋亡的發(fā)生(bcl-2、bcl-xl、bcl-w、Mcl-1)。c-myc基因：能促進(jìn)細(xì)胞的增殖，也能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。H-ras基因：編碼p21蛋白，促進(jìn)細(xì)胞的

14、增殖，抑制細(xì)胞凋亡。415.可觸發(fā)細(xì)胞凋亡的可觸發(fā)細(xì)胞凋亡的fas和和fasL fas又稱Apo-1,即CD95分子，是腫瘤壞死因子受體及神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體家族成員。fas是細(xì)胞表面的凋亡信號(hào)受體，存在于多種動(dòng)物細(xì)胞表面。fas與fas配體(fas ligand，fasL)相互作用，可導(dǎo)致表達(dá)fas的細(xì)胞凋亡發(fā)生。42 fas與fas配體(fas ligand,fasL)相互作用，可導(dǎo)致表達(dá)fas的細(xì)胞凋亡發(fā)生。1.死亡受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡 fas/fasL FADD caspase-8（啟動(dòng)者）caspase-3（執(zhí)行者）細(xì)胞凋亡FADD：fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域（三）細(xì)胞凋亡的發(fā)生機(jī)制（三）細(xì)胞凋

15、亡的發(fā)生機(jī)制43死亡受體死亡受體TNF-R1和和Fas（Apo-1，CD95），），胞質(zhì)部分含有死亡結(jié)構(gòu)域（胞質(zhì)部分含有死亡結(jié)構(gòu)域（DD），負(fù)責(zé)招），負(fù)責(zé)招募凋亡信號(hào)通路中的信號(hào)分子。募凋亡信號(hào)通路中的信號(hào)分子。Fas與配體（如與配體（如TNF）結(jié)合發(fā)生三聚化，）結(jié)合發(fā)生三聚化，使使胞內(nèi)的胞內(nèi)的DD 區(qū)（區(qū)（Death domain）與接頭蛋）與接頭蛋白白FADD的的DD區(qū)結(jié)合。區(qū)結(jié)合。FADDN 端通過(guò)端通過(guò)DED 區(qū)（區(qū)（death effector domain）與）與Caspase-8前體蛋白和前體蛋白和CAP3 結(jié)結(jié)合，合，激活激活Caspase-8。2.2.線粒體細(xì)胞凋亡途徑線粒體

16、細(xì)胞凋亡途徑線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔（PTP）改變,釋放細(xì)胞色素C，細(xì)胞色素C與caspase-9前體、ATP/dATP形成凋亡復(fù)合體，然后召集并激活caspase-3，進(jìn)而引發(fā)caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，對(duì)凋亡信號(hào)進(jìn)行放大，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。453.Caspase非依賴性的細(xì)胞凋亡非依賴性的細(xì)胞凋亡Caspase非依賴性的細(xì)胞凋亡確實(shí)存在，但機(jī)制仍不完全清楚。非依賴性的細(xì)胞凋亡確實(shí)存在，但機(jī)制仍不完全清楚。凋亡誘導(dǎo)因子（凋亡誘導(dǎo)因子（AIF）位于線粒體外膜，可以轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)，）位于線粒體外膜，可以轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)，并進(jìn)入細(xì)胞核，引發(fā)核內(nèi)并進(jìn)入細(xì)胞核，引發(fā)核內(nèi)DNA凝集并斷裂形成凝集并斷裂形成50kb大小大小的的片段。片段。限制性內(nèi)切核酸酶限制性內(nèi)切核酸酶G（Endo G)可以誘發(fā)可以誘發(fā)Caspase非依賴性的非依賴性的細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡。Endo G屬于依賴性的核酸酶家族，定位于線粒屬于依賴性的核酸酶家族，定位于線粒體，在線粒體中，負(fù)責(zé)線粒體體，在線粒體中，負(fù)責(zé)線粒體DNA的修復(fù)和復(fù)制。受到凋亡的修復(fù)和復(fù)制。受到凋亡信號(hào)刺激，從線粒體進(jìn)入細(xì)胞核，對(duì)核信號(hào)刺激，從線粒體進(jìn)入細(xì)胞核，對(duì)核DNA進(jìn)行切割。在進(jìn)行切割。在Caspase未被激活的情況下，產(chǎn)生典型的以核小體為單位的未被激活的情況下，產(chǎn)生典型的以核小體為單位的DNA片段。片段。