《DNA的復制和修復》PPT課件

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1、六、真核生物DNA的復制 （一）參與復制的酶及蛋白質(zhì)因子1. DNA聚合酶：pol 、 、 （I） （I V） （M） （I I I） （I I）位置細胞核細胞核線粒體細胞核細胞核亞基數(shù)目4 1 2 2 13 5 外切酶- - + + +引物合成酶+ - - - -持續(xù)合成能力中等低高有PCNA時高高準確性高低高高高 功能引物合成修復線粒體DNA合成核DNA合成修復 2. 復制體的組成（與原核生物相比較）真 核 生 物復 制 酶 pol/ 進 行 性 因 子 增 殖 細 胞 核 抗 原 （ PCNA）夾 子 裝 置 器 RF-C(replication factor C)引 物 合 成 酶 p

2、ol去 除 引 物 RNaseH1 和 MF-1（ 53外 切 酶 ）滯 后 鏈 修 復 pol 和 DNA連 接 酶消 除 拓 撲 張 力 拓 撲 異 構(gòu) 酶解 螺 旋 酶 T抗 原單 鏈 結(jié) 合 RP-A ( replication protein A) SSBDnaB旋 轉(zhuǎn) 酶pol和 DNA連 接 酶polDnaG復 合 物夾 子pol 原 核 生 物 A schematic view of the major components at the eukaryotic replication fork.MF-1（單鏈結(jié)合蛋白）（復制酶）（夾子）（夾子裝置器）（拓撲異構(gòu)酶）（解旋酶）（引

3、物合成酶）（DNA連接酶） Structure of the PCNA homotrimer. Note that the trimeric PCNA ring of eukaryotes is remarkably similar to its prokaryotic counterpart, the dimeric sliding clamp. （二）真核生物DNA復制過程1.真核與原核生物在復制過程上的相同之處： -半 不 連 續(xù) 復 制 ； -具 有 相 似 的 起 始 、 延 伸 等 過 程 。 原 核 生 物 真 核 生 物復 制 子 1個 多 個起 始 點 1個 （ 可 連 續(xù)

4、啟 動 復 制 ） 多 個延 伸 速 度 105bp/min 10003000bp/min岡 崎 片 段 10002000個 核 苷 酸 100200個 核 苷 酸引 發(fā) 策 略 引 物 合 成 酶 催 化 合 成 引 物 pol催 化 合 成 引 物 和寡 聚 脫 氧 核 苷 酸延 伸 策 略 由 pol異 源 二 聚 體 催 化 前 導鏈 和 滯 后 鏈 的 合 成 兩 個 pol分 別 催 化 前 導鏈 和 滯 后 鏈 的 合 成2. 真核與原核生物DNA復制一般特點的比較 （三）端粒及端粒的合成1. 端粒（telomere） 真 核 生 物 線 性 染 色 體 末 端 的 特 殊 結(jié)

5、構(gòu) ， 由 許多 成 串 短 的 重 復 順 序 組 成 ， 具 有 穩(wěn) 定 染 色 體 末端 結(jié) 構(gòu) 的 功 能 。四 膜 蟲 TTGGGG(僅 列 一 條 鏈 的 序 列 )人 TTAGGG 2. 端粒酶（telomerase） 含 有 RNA鏈 的 逆 轉(zhuǎn) 錄 酶 ， 它 以 所 含 RNA為 模板 來 合 成 DNA端 粒 結(jié) 構(gòu) 。3. 端粒的合成 端 粒 酶 結(jié) 合 到 端 粒 的 3末 端 上 ， 酶 分 子 中RNA鏈 5 末 端 識 別 DNA 3末 端 并 互 補 配 對 。 以RNA鏈 為 模 板 使 DNA鏈 延 伸 ， 合 成 一 個 重 復 單位 后 再 向 前 移

6、 動 一 個 單 位 。 3單 鏈 可 回 折 作 為引 物 ， 合 成 其 互 補 鏈 。 (a)Telomeres on human chromosomes consist of the hexanucleotide sequence TTAGGG repeated between 1000 and 1700 times. (b) Like other telomerases, human telomerase is a ribonucleoprotein. Problem posed in the replication of linear DNA : the end of one da

7、ughter strand will be shortened after each round of replication. Synthesis of telomeric DNA by telomerase extends the 3-end. 七、生物體DNA復制的基本特點 復 制 方 式 為 半 保 留 復 制 。 復 制 起 始 于 特 定 位 置 ； 原 核 生 物 、 病 毒 是 單 復 制子 ， 具 一 個 復 制 起 點 ； 真 核 生 物 是 多 復 制 子 ， 具 多個 復 制 起 點 。 復 制 有 單 向 和 雙 向 復 制 （ 后 者 更 為 常 見 ） 。 復 制

8、 時 ， DNA鏈 由 53延 伸 ， 需 RNA引 物 ， 復 制 過 程 為 半 不 連 續(xù) 復 制 。 第二節(jié) DNA的損傷及修復 導致DNA損傷的因素生物因素：物理因素：化學因素：復 制 錯 誤 等 。紫外線電離輻射如：HNO2 烷化劑可 使 同 一 條 鏈 上 相 鄰 嘧 啶 形 成嘧 啶 二 聚 體（TT, CT, CC） 打 斷 DNA雙 鏈 或 單 鏈 ， 破 壞 堿 基使 堿 基 脫 氨 基 ， AI, CU， 造 成堿 基 錯 配可 導 致 堿 基 錯 配 、 DNA交 聯(lián) 、 堿 基脫 嘌 呤 等 修復系統(tǒng) 錯 配 修 復 直 接 修 復 切 除 修 復 重 組 修 復

9、傾 錯 修 復 （一）錯配修復（mismatch repair）定 義 ： 復 制 后 的 DNA在 短 時 間 內(nèi) GATC序 列 是 半 甲 基化 的 ， 一 旦 發(fā) 現(xiàn) 錯 配 堿 基 ， 包 括 錯 配 堿 基 在 內(nèi) 的 未甲 基 化 的 新 鏈 可 被 切 除 ， 并 以 甲 基 化 的 鏈 為 模 板 進行 修 復 合 成 。 （二）直接修復某 些 損 傷 的 核 苷 酸 和 錯 配 的 堿 基 可 以 被 某 些蛋 白 質(zhì) 識 別 和 修 復 ， 這 些 蛋 白 質(zhì) 為 了 能 夠 找出 特 別 損 傷 部 位 可 以 連 續(xù) 監(jiān) 測 DNA。 這 些 蛋白 質(zhì) 不 切 斷 D

10、NA或 切 除 堿 基 而 是 直 接 實 施 修復 ， 這 樣 的 損 傷 修 復 機 制 稱 為 直 接 修 復 。 可 見 光 激 活 光 復 活 酶 ， 其 可 以 分 解由 于 紫 外 線 照 射 形 成 的 嘧 啶 二 聚 體 ， 恢復 DNA的 正 常 結(jié) 構(gòu) 。光復活修復（photoreactivation repair） 此 修 復 方 式 從 低 等 生 物 到 鳥 類 皆 有 ，在 植 物 中 比 較 重 要 。 DNA is distorted at the site of T-T dimer. 通 過 光 復 活 酶 修 復 胸 腺 嘧 啶 二 聚 體 的 過 程 （

11、三）切除修復(excision repair)v定義：v 包括：堿 基 切 除 修 復 （ base-excision repair）核 苷 酸 切 除 修 復 （ nucleotide-excision repair） 在 一 系 列 酶 的 作 用 下 ， 將 DNA分 子 中 受 損 傷部 分 切 除 掉 ， 并 以 完 整 鏈 的 一 條 鏈 為 模 板 ， 合 成切 去 的 部 分 ， 使 DNA恢 復 正 常 結(jié) 構(gòu) 的 過 程 。 （四）重組修復v定義： 含 有 嘧 啶 二 聚 體 或 其 他 結(jié) 構(gòu) 損 傷 的 DNA進 行 復 制時 ， 子 代 DNA鏈 在 損 傷 部 位

12、出 現(xiàn) 缺 口 。 通 過 遺 傳 重 組 ，從 完 整 的 母 鏈 上 將 相 應 的 片 段 移 至 子 鏈 的 缺 口 處 ， 然后 用 再 合 成 的 多 核 苷 酸 鏈 補 上 母 鏈 的 空 缺 。 （五）應急反應(SOS)和易錯修復 許 多 可 造 成 DNA損 傷 或 抑 制 復 制 的 處 理 均 能 引起 一 系 列 復 雜 的 誘 導 反 應 ， 稱 為 SOS反 應 。 1. 應急反應包括：DNA損 傷 修 復誘 變 效 應細 胞 分 裂 的 抑 制溶 原 性 細 菌 釋 放 噬 菌 體（ 細 胞 癌 變 也 與 SOS反 應 有 關(guān) ） 傾 錯 的 DNA聚 合 酶

13、IV、 V避免差錯的修復（error free repair）傾向差錯的修復（error prone repair）2. SOS反應誘導的修復系統(tǒng)錯 配 修 復 、 直 接 修 復 、切 除 修 復 、 重 組 修 復3. SOS反應機制 由Rec A蛋白和LexA阻遏物相互作用引起的。 4. SOS反應的意義 SOS反 應 包 括 兩 方 面 ： DNA修 復 和 導 致 變異 。 修 復 可 使 DNA恢 復 正 常 結(jié) 構(gòu) ， 而 變 異 可 增加 物 種 生 存 的 機 會 ， 在 進 化 中 是 十 分 有 意 義 的 。 第三節(jié) RNA指導下的DNA的合成 逆轉(zhuǎn)錄作用（revers

14、e transcription） 是 以 RNA為 模 板 ， 即 按 照 RNA中 的核 苷 酸 順 序 合 成 DNA的 過 程 。 1964 年 ， Temin 提 出 前 病 毒 學 說 ， 即 在 致 癌RNA病 毒 的 感 染 過 程 中 存 在 一 個 DNA中 間 體（ 前 病 毒 ） 。 1970年 ， Temin和 Baltimore分 別 從 致 癌 RNA病毒 中 發(fā) 現(xiàn) 逆 轉(zhuǎn) 錄 酶 。（一）逆轉(zhuǎn)錄酶（reverse transcriptase）的發(fā)現(xiàn)致 癌 RNA病 毒 是 一 大 群 能 引 起 鳥 類 、 哺 乳 類 等 動 物 白 血 病 和肉 瘤 以 及

15、其 它 腫 瘤 的 病 毒 。 這 類 病 毒 侵 染 細 胞 后 并 不 引 起 細胞 死 亡 ， 卻 可 以 使 細 胞 發(fā) 生 惡 性 轉(zhuǎn) 化 。 1975年 ， 獲 諾貝 爾 生 理 醫(yī) 學獎 。 （二）逆轉(zhuǎn)錄酶的性質(zhì)活性： RNA指導的DNA聚合酶活力 DNA指導的DNA聚合酶活力 核糖核酸酶H的活力以 4種 dNTP為 底 物需 要 有 模 板 和 引 物聚 合 方 向 ： 53 需 Mg2+（ Mn2+） 數(shù)目：70個/ 病毒粒子 結(jié)構(gòu)：含、兩個亞基 逆轉(zhuǎn)錄病毒的基因組通常有兩條相同的（+）RNA鏈所組成，在靠近5端的區(qū)域以氫鍵結(jié)合在一起。 5端具有帽子結(jié)構(gòu)，3端具有多聚腺苷酸。

16、靠近5有1分子宿主tRNA，作為逆轉(zhuǎn)錄引物。典型逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組長約7000-100000核苷酸，攜帶3個基因（gag，編碼核心蛋白、pol，編碼蛋白酶、整合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、env，編碼膜蛋白)?；蚪MRNA的兩端具有同樣的序列，成為正向重復。 General structure of an integrated retrovirus genome. The long terminal repeats (LTRs) have sequences needed for the regulation and initiation of transcription. The sequence deno

17、ted is required for packaging retroviral RNAs into mature virus particles. （三）逆 轉(zhuǎn) 錄 病 毒 生 活 史 :逆 轉(zhuǎn) 錄 病 毒在 逆 轉(zhuǎn) 錄 酶 的 催 化 下 ， 以 病 毒 的 RNA為 模 板 合 成， 形 成 RNA-DNA雜 化 體 ， 逆 轉(zhuǎn) 錄 酶將 雜 化 體 中 的 RNA降 解 ， 同 時 以 剩 下 的 DNA鏈 為 模 板合 成 另 一 條 互 補 的 DNA鏈 ，雙 鏈 DNA 中利 用 宿 主 復 制 和 轉(zhuǎn) 錄 機 器 生 產(chǎn) 大 量 的 轉(zhuǎn) 錄 出 的 mRNA翻 譯 成 病 毒

18、的 包 膜 蛋 白 ， 逆 轉(zhuǎn) 錄 酶和 殼 體 蛋 白將 病 毒 RNA、 逆 轉(zhuǎn) 錄 酶 和 殼 體 蛋 白 組 裝 成 病 毒 的核 殼 體核 殼 體 結(jié) 合 包 膜 蛋 白 形 成逆 轉(zhuǎn) 錄 酶 沒 有 3-5外 切 酶 活 性 或 校 正 活 性 ， 所 以 它的 錯 誤 率 比 任 何 DNA聚 合 酶 都 高 +病毒RNA侵染宿主細胞RNA-cDNA雜交分子RNA指導的DNA聚合酶-DNA整合入染色體基因組DNA指導的DNA聚合酶- +雙鏈DNA逆轉(zhuǎn)錄過程核糖核酸酶H病毒RNA 自身蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄翻譯+ cDNA： 幾 乎 所 有 真 核 生 物 mRNA分 子 的 3 末 端 都 有一 段 polyA,當 加 入 寡 聚 dT作 為 引 物 時 ， mRNA就 可 作為 模 板 ， 在 逆 轉(zhuǎn) 錄 酶 催 化 下 在 體 外 合 成 與 其 互 補 的DNA， 稱 為 cDNA。 （四）逆轉(zhuǎn)錄酶應用與逆轉(zhuǎn)錄研究意義逆轉(zhuǎn)錄酶的應用（如：cDNA的獲得、逆轉(zhuǎn)錄病毒病毒作為信息載體作為基因治療等）研究意義：揭示HIV病毒和嗜肝DNA病毒的致病機理與防治研究用于分子生物學研究的材料