食品中有毒有害物質(zhì)的快速檢測(cè)方法ppt課件

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1,第一節(jié) 農(nóng)藥殘留的快速檢測(cè) 第二節(jié) 獸藥殘留的快速檢測(cè) 第三節(jié) 真菌毒素及化學(xué)污染物的快速檢測(cè) 第四節(jié) 致病微生物的快速檢測(cè) 第五節(jié) 食品中異物的檢測(cè)方法,第二章 食品中有毒有害物質(zhì)的 快速檢測(cè)方法,2,一、何為快速檢測(cè),快速檢測(cè)沒(méi)有經(jīng)典的定義，而是一種約定俗成的概念，即：包括樣品制備在內(nèi)，能夠在短時(shí)間內(nèi)出據(jù)檢測(cè)結(jié)果的行為稱(chēng)之為快速檢測(cè)。,3,二、快速檢測(cè)的時(shí)間概念,理化快速檢驗(yàn)方法：包括樣品制備在內(nèi)，能夠在兩小時(shí)以?xún)?nèi)出具檢測(cè)結(jié)果，即可視為實(shí)驗(yàn)室快速檢測(cè)方法。 如果方法能夠應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)，在30分鐘內(nèi)出具檢測(cè)結(jié)果，即可視為現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)方法。如果能夠在10幾分鐘甚至幾分鐘內(nèi)得到檢測(cè)結(jié)果，可視其為比較理想的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)方法。 微生物快速檢驗(yàn)方法：與傳統(tǒng)檢驗(yàn)方法相比，能夠縮短1/2或1/3的檢測(cè)時(shí)間，就可得到檢測(cè)結(jié)果, 可視為快速檢測(cè)方法。,4,第一節(jié) 農(nóng)藥殘留的快速檢測(cè),農(nóng)藥是指用于消滅、控制危害農(nóng)作物的害蟲(chóng)、病菌、鼠類(lèi)、雜草、及其它有害動(dòng)植物和調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)的藥物。,5,按用途分九種： 殺蟲(chóng)劑、殺螨劑、殺線蟲(chóng)劑、殺軟體動(dòng)物劑、殺鼠劑、殺菌劑、除草劑、脫葉劑、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。 農(nóng)藥殘留：農(nóng)藥使用后殘存于生物體、農(nóng)副產(chǎn)品和環(huán)境中的微量農(nóng)藥原體、毒代謝物、降解物和雜質(zhì)的總稱(chēng)，殘存的數(shù)量稱(chēng)殘留量，一般以每千克中有多少毫克表示。 農(nóng)藥殘留量是施藥后的必然現(xiàn)象，但如果超過(guò)最大殘留量，對(duì)人畜產(chǎn)生不良影響或通過(guò)食物鏈對(duì)生態(tài)系統(tǒng)中的生物造成毒害，則稱(chēng)為農(nóng)藥殘留毒性（簡(jiǎn)稱(chēng)殘毒）。,6,目前，我國(guó)農(nóng)藥殘留較為突出的是蔬菜中的農(nóng)藥殘留問(wèn)題。近年來(lái)蔬菜被農(nóng)藥污染的情況有增無(wú)減，有機(jī)磷農(nóng)藥殘留尤為突出。,有機(jī)磷農(nóng)藥多為磷酸酯類(lèi)或硫代磷酸酯： 對(duì)硫磷（1605）、內(nèi)吸磷（1059）、馬拉硫磷（4049）、樂(lè)果、敵百蟲(chóng)、敵敵畏。,7,控制蔬菜中農(nóng)藥殘留對(duì)人體的危害，最為有效的方法之一是加強(qiáng)對(duì)蔬菜中的農(nóng)藥殘留檢測(cè)的力度。 傳統(tǒng)的農(nóng)藥分析主要依賴(lài)于氣相或液相色譜等儀器，儀器分析雖然可以檢出樣品中較微量的農(nóng)藥，但操作復(fù)雜、費(fèi)時(shí)費(fèi)工、檢測(cè)成本較高。,8,農(nóng)藥殘留快速測(cè)定方法從反應(yīng)原理上分為生物法和化學(xué)法。生物法: 活體生物測(cè)定法:使用發(fā)光細(xì)菌或敏感性家蠅作為測(cè)定材料。 分子生物學(xué)方法:采用免疫反應(yīng)如酶聯(lián)免疫反應(yīng)。 生物化學(xué)測(cè)定法:利用膽堿酯酶抑制原理。,9,農(nóng)藥殘留快速測(cè)定法從儀器使用上分為： 氣相色譜儀法 液相色譜儀法 農(nóng)藥殘留分光光度法(抑制率法) 目視法(如有機(jī)磷農(nóng)藥速測(cè)靈法、農(nóng)藥殘 留試紙法、酶片法)。,10,一、免疫分析技術(shù),? 常用于農(nóng)藥殘留分析的免疫分析技術(shù)有：,酶免疫技術(shù),放射免疫技術(shù),RIA,EIA,11,1.放射免疫技術(shù),放射免疫技術(shù)是以放射性同位素為標(biāo)記物的標(biāo)記免疫分析法,用于定量測(cè)定受檢標(biāo)本中的抗原或抗體。 基本原理是：采用定量的標(biāo)記抗原（Ag*）和非標(biāo)記抗原（Ag）對(duì)有限量特異性抗體(Ab)的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合反應(yīng)。,12,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,結(jié)合型的標(biāo)記抗原Ag*-Ab(B),游離型標(biāo)記抗原Ag*(F),放射免疫分析法的原理與方法,13,,先將放射性同位素標(biāo)記已知抗原或抗體，與待檢標(biāo)本反應(yīng)后，用γ射線探測(cè)儀或閃爍計(jì)算器測(cè)定γ射線或β射線的放射性強(qiáng)度，根據(jù)放射性強(qiáng)度計(jì)算標(biāo)本中抗原或抗體的含量。 它將放射性核素顯示的高靈敏性和抗原抗體反應(yīng)的特異性結(jié)合，使檢測(cè)的敏感性達(dá)10pg水平。 常用于標(biāo)記的同位素有8H、125I和3H 。,14,測(cè)定方法與步驟,(1)抗原抗體反應(yīng)：平衡法。 (2)分離結(jié)合與游離標(biāo)記物 沉淀劑沉淀復(fù)合物，離心分離。 (3)放射性測(cè)定及數(shù)據(jù)處理 晶體閃爍計(jì)數(shù)儀(γ射線)或液體閃爍計(jì)數(shù)儀( β射線)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算待檢抗原濃度。,15,β液閃儀,16,γ計(jì)數(shù)器,但是由于放射免疫分析法需要較昂貴的液體閃爍儀或放射儀，且放射性同位素對(duì)工作人員有一定的傷害，廢棄物又不易處理，這些不利因素限制了該法的廣泛應(yīng)用。,17,2.酶免疫技術(shù)(EIA ),酶免疫技術(shù)是用酶標(biāo)記的已知抗原或抗體，檢測(cè)標(biāo)本中的相應(yīng)抗體或抗原，將抗原抗體反應(yīng)的特異性與酶催化反應(yīng)的專(zhuān)一性相結(jié)合的免疫檢測(cè)技術(shù)。,18,酶聯(lián)免疫吸附法 （enzyme linked immunosorbant assay， ELISA）,酶聯(lián)免疫吸附法是把抗原抗體反應(yīng)的特異性和酶的高效催化作用有機(jī)結(jié)合起來(lái)的一種免疫檢測(cè)技術(shù)。 將已知抗原或抗體吸附在固相載體(聚苯乙烯板)上進(jìn)行酶免疫反應(yīng)，檢測(cè)相應(yīng)的抗體或抗原。 應(yīng)用：食品中毒素的測(cè)定、食品有害微生物的快速檢測(cè)、食品中農(nóng)藥殘留的檢測(cè)、食品中抗生素殘留的檢測(cè) （如氯霉素）,19,ELISA基本原理,使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。 使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。 把受檢標(biāo)本（測(cè)定其中的抗體或抗原）和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。,20,用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開(kāi)，最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。 加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺進(jìn)行定性或定量分析。,21,ELISA原理圖,,,22,ELISA基本的實(shí)驗(yàn)過(guò)程,23,ELISA可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體,在這種測(cè)定方法中有3種必要的試劑：,①固相的抗原或抗體,②酶標(biāo)記的抗原或抗體,③酶作用的底物,24,ELISA的一般操作方法,固相載體的準(zhǔn)備：最常用的是聚苯乙烯微量反應(yīng)板，規(guī)格有40孔、72孔、96孔，板孔呈凹型，應(yīng)用方便。 抗原或抗體的包被：將Ag或Ab吸附到固相載體的過(guò)程稱(chēng)為包被。 固相載體的封閉：固相載體包被Ag(或Ab)后，載體表面可能因殘留未吸附蛋白質(zhì)的活性部位而吸附抗體或酶標(biāo)抗體，引起試驗(yàn)誤差；因此需事先用含0.5％BSA-0.05％吐溫-20的PBS封閉30～60分鐘（37℃），以降低非特異性吸附。,25,固相載體的洗滌：洗滌是在整個(gè)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定的操作過(guò)程中不可缺少的一個(gè)步驟，每加一層反應(yīng)結(jié)束后均要洗滌固相載體板，目的在于防止重疊反應(yīng)引起的非特異性吸附。---常用的洗滌液為：0.02M，pH7.2(或7.4)的PBS(含NaCl 0.15M，0.05％吐溫-20)；洗滌時(shí)先將加入的反應(yīng)液倒干，然后加洗滌液于孔中，泡洗3分鐘，重復(fù)3次，最后傾去洗滌液，用吸水紙吸干。,26,雙抗體夾心法是檢測(cè)抗原最常用的方法。 方法：先將已知抗體吸附在固相載體上，加入待檢抗原，再加入酶標(biāo)記的已知抗體，反應(yīng)后形成“抗體-抗原-酶標(biāo)抗體”復(fù)合物，最后加入酶的底物顯色。應(yīng)用：常用于檢驗(yàn)各種蛋白質(zhì)等大分子抗原。適用于分子中具有至少兩個(gè)抗原決定簇的多價(jià)抗原，而不能用于小分子半抗原的檢測(cè)。,雙抗體夾心法,27,,28,,,,1、已知抗體包被于載體表面,3、加酶標(biāo)抗體與抗原結(jié)合,4、加酶作用的底物 產(chǎn)生顏色,2、加待檢物 抗原與抗體結(jié)合,4、加酶作用的底物不產(chǎn)生顏色,,,,雙抗體夾心法測(cè)抗原,,1、已知抗體包被于載體表面,2、加待檢物無(wú)抗原與抗體結(jié)合,3、加酶標(biāo)抗體無(wú)抗原結(jié)合,+,-,Y,,Y,E,Y,,Y,Y,Y,Y,Y,,,,,Y,Y,,Y,Y,,,,Y,Y,Y,Y,Y,Y,29,原理為標(biāo)本中的抗原(抗體)和一定量的酶標(biāo)抗原(抗體)競(jìng)爭(zhēng)與固相抗體(抗原)結(jié)合。 方法：用已知抗體(抗原)包被，加入待測(cè)血清，再加酶標(biāo)抗原(抗體)，酶標(biāo)抗原(抗體)與待檢物競(jìng)爭(zhēng)與包被物結(jié)合。加底物顯色。 應(yīng)用：可用于測(cè)定抗原和半抗原，也可用于測(cè)定抗體。,競(jìng)爭(zhēng)法,30,,,,,,,,競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原,+,-,,Y,,Y,Y,Y,Y,Y,,Y,Y,E,Y,,,,2、加待檢物 抗原與酶標(biāo)抗 原競(jìng)爭(zhēng)與抗體 結(jié)合,3、加酶作用 的底物不顯色 或顯色弱,3、加酶作用 的底物顯色,1、已知抗體包 被于載體表面,1、已知抗體包 被于載體表面,2、加待測(cè)物 和酶標(biāo)抗原， 酶標(biāo)抗原與抗 體結(jié)合,31,,原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體以檢測(cè)已與固相結(jié)合的受檢抗體，故稱(chēng)為間接法。方法：先將已知抗原吸附在固相載體上，加入待檢血清，再加入酶標(biāo)記的抗抗體，反應(yīng)后形成“抗原-抗體-酶標(biāo)抗抗體”復(fù)合物，最后加入酶的底物顯色。優(yōu)點(diǎn)：一種酶標(biāo)抗抗體檢測(cè)各種與抗原相應(yīng)的抗體應(yīng)用：主要用于對(duì)病原體抗體的檢測(cè)而進(jìn)行傳染病的診斷。,間接法,32,33,34,底物顯色 ：必須用反應(yīng)后能形成水溶溶性色素的供氫體，常用的有鄰苯二胺 (CPD)，聯(lián)苯茴香胺，5-氨基水楊酸和鄰聯(lián)甲苯胺 。于用前配制避光保存，加入反應(yīng)孔作用20～30min。 顯色終止：陰性對(duì)照孔微微出現(xiàn)顏色，加入終止液（2M H2SO4）,35,結(jié)果判定：在白色背景上，用肉眼觀察，每批試驗(yàn)均需有陰性對(duì)照。顏色反應(yīng)明顯深于對(duì)照組者判為陽(yáng)性。 酶標(biāo)儀測(cè)定，待檢孔OD值 (P)與對(duì)照孔OD值(N)的比值(P/N)大于1.5或2.0者為陽(yáng)性。 定量測(cè)定：對(duì)于抗原的定量測(cè)定（如酶標(biāo)記抗原競(jìng)爭(zhēng)法），需事先用標(biāo)準(zhǔn)抗原制備一條吸收值與濃度的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)曲線，只要測(cè)出樣品的吸收值，即可查出其抗原濃度。,36,優(yōu)點(diǎn): ①可以通過(guò)顏色來(lái)快速做定性結(jié)果分析; ②特異性強(qiáng); ③靈敏度高; ④酶標(biāo)板上一次可作多份樣品檢測(cè)。,37,標(biāo)記酶要求很高，應(yīng)具備:①純度高、溶解性高、特異性強(qiáng)、 穩(wěn)定性高;②測(cè)定方法應(yīng)簡(jiǎn)單、敏感、快速;③與底物作用后會(huì)呈現(xiàn)顏色;④與抗體交聯(lián)后，仍保持酶的活性。,38,最常用的是辣根過(guò)氧化物酶(HRP)，它廣泛存在于植物界，辣根中的含量尤高。HRP是一種糖蛋白，由酶蛋白和鐵啉結(jié)合而成，相對(duì)分子質(zhì)量為40000，其底物是二氨基聯(lián)苯胺(DAB)，DAB經(jīng)酶解可產(chǎn)生棕褐色沉淀物。因而可用目測(cè)或用比色法測(cè)定。 還有堿性磷酸酶、酸性磷酸酶、蘋(píng)果酸脫氫酶、葡萄糖氧化酶和β-D-半乳糖苷酶等可供應(yīng)用。,39,3.RIA和EIA技術(shù)異同點(diǎn),相同點(diǎn)：1)RIA與EIA技術(shù)的原理基本一致，即抗原與抗體反應(yīng)，形成抗原一抗體復(fù)合物。2)RIA與EIA檢測(cè)技術(shù)都是由反應(yīng)系統(tǒng)和檢測(cè)系統(tǒng)組成， 不同點(diǎn)：1)RIA技術(shù)以放射性同位素作指示劑(標(biāo)記物)；而在EIA技術(shù)中，用作標(biāo)記物的指示劑為生物酶。,40,2)RIA技術(shù)操作過(guò)程中檢測(cè)放射性同位素需要昂貴的儀器設(shè)備和防輻射設(shè)備，并且需要專(zhuān)業(yè)人員。相對(duì)于RIA技術(shù)而言，EIA技術(shù)有更多的優(yōu)點(diǎn)，如靈敏度高、特異性強(qiáng)、成本低、簡(jiǎn)便快速、自動(dòng)化程度高、檢測(cè)方法多樣和安全等。 因此，EIA技術(shù)，尤其是酶聯(lián)免疫吸附分析技術(shù)(ELISA)，已成為目前使用最普及的免疫分析技術(shù)。,41,目前，國(guó)外已研制出幾十種農(nóng)藥的酶免疫檢測(cè)試劑盒，包括有機(jī)磷類(lèi)、氦基甲酸酯類(lèi)、硫代氨基甲酸酯類(lèi)、有機(jī)氯類(lèi)、擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)及酰胺類(lèi)等。 美國(guó)使用的ELISA試劑盒對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥普遍的最小檢出濃度達(dá)20pg/kg，對(duì)氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥普遍的最小檢出濃度達(dá)300ug/kg。 免疫檢測(cè)試劑盒使用起來(lái)簡(jiǎn)便、快速，操作人員不需經(jīng)過(guò)特殊培訓(xùn)，樣品不需凈化或只需簡(jiǎn)單的凈化。,42,二、生物化學(xué)測(cè)定法,生物化學(xué)測(cè)定法包括農(nóng)藥速測(cè)卡法、農(nóng)藥速測(cè)片法、農(nóng)藥殘留分光光度計(jì)法。 運(yùn)用膽堿酯酶抑制法檢測(cè)有機(jī)磷和氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥的一種快速現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)方法。,農(nóng)藥殘留速測(cè)儀,43,1.農(nóng)藥速測(cè)卡法農(nóng)藥速測(cè)卡法又稱(chēng)農(nóng)藥殘留試紙法、酶試紙法。 原理：膽堿酯酶可催化靛酚乙酸酯(紅色)水解為乙酸靛酚(藍(lán)色)，有機(jī)磷或氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥對(duì)膽堿酯酶有抑制作用，使催化、水解、變色的過(guò)程發(fā)生改變，由此可判斷出樣品中是否含有有機(jī)磷或氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥的存在。,,44,蔬菜表面測(cè)定法（粗篩法）：擦去蔬菜表面泥土，滴2～3滴浸提液在蔬菜表面，用另一片蔬菜在滴液處輕輕摩擦。取一片速測(cè)卡，將蔬菜上的液滴滴在白色藥片上。放置10min進(jìn)行預(yù)反應(yīng)，將速測(cè)卡對(duì)折后，用手捏3min時(shí)，打開(kāi)與空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)卡比較判定。,分析步驟：,45,蔬菜整體測(cè)定法：選取有代表性的蔬菜樣品，擦去表面泥土，剪成1cm左右見(jiàn)方碎片，取5g放入帶蓋瓶中，加入10mL浸提液，震搖50次，靜置2min以上。取2～3滴浸提液滴在速測(cè)卡上，以下操作與表面測(cè)定法相同。 飲用水中污染農(nóng)藥的檢測(cè)：直接取2～3滴加到速測(cè)卡上進(jìn)行操作。,46,中毒殘留物中農(nóng)藥的檢測(cè)：取樣品適量于容器中，加入2倍量的乙酸乙酯，充分震搖后靜置，取澄清液于蒸發(fā)皿中，在水浴上蒸干乙酸乙酯，取1mL磷酸鹽浸提液溶解蒸干后的殘?jiān)?，取殘?jiān)芤?～3滴于速測(cè)卡白色藥片上進(jìn)行檢測(cè)。,47,結(jié)果判定：,48,速測(cè)卡法測(cè)定結(jié)果,與空白對(duì)照卡比較,49,2.農(nóng)藥殘留分光光度計(jì)法又稱(chēng)抑制率法。利用膽堿酯酶原理。在一定條件下，有機(jī)磷和氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥對(duì)膽堿酯酶有抑制作用，其抑制率與農(nóng)藥的濃度呈正相關(guān)系。如果樣本提取液中含有有機(jī)磷和氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥，酶的活性就被抑制，試驗(yàn)中加入的基質(zhì)就不能被酶水解，從而不顯色或顏色變化很小;如果樣本提取液中不含有機(jī)磷和氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥，酶的活性就不被抑制，試驗(yàn)中加入的基質(zhì)就被酶水解或少部分水解，水解產(chǎn)物與加入的顯色劑反應(yīng)產(chǎn)生顏色，用分光光度計(jì)測(cè)定吸光值隨時(shí)間的變化，計(jì)算機(jī)出抑制率，就可以判斷出蔬菜中含有機(jī)磷或氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥的殘留情況。,50,,51,操作步驟：,① 樣品處理：選取有代表性的蔬菜樣品，檫去表面泥土，剪成1cm左右見(jiàn)方碎片，取1g放入燒杯或提取瓶中，加入5mL緩沖溶液浸沒(méi)菜葉，每3min搖動(dòng)一下燒杯，于10min后吸取2.5mL提取液于試管，待測(cè)。,52,② 測(cè)定： 對(duì)照溶液測(cè)試：于試管中加入2.5mL緩沖溶液，再加入0.1mL酶液、0.1mL底物搖勻，此時(shí)檢液開(kāi)始顯色反應(yīng)，應(yīng)立即放入儀器比色池中，于410nm波長(zhǎng)下比色，記錄反應(yīng)3min的吸光度變化值或儀器記錄值A(chǔ)0。 樣品測(cè)試：于試管中加入2.5mL樣品提取液，其它操作與對(duì)照溶液測(cè)試相同，記錄反應(yīng)3 min的吸光度變化值或儀器記錄值A(chǔ)t。 ③ 結(jié)果的表述計(jì)算： 注意：使用速測(cè)儀可以直接讀出抑制率值，而無(wú)須手工計(jì)算。,53,,結(jié)果判定,如現(xiàn)有方法在使用乙酰膽堿酯酶時(shí)，抑制率為50%;使用丁酰膽堿酯酶時(shí)，抑制率定為70%。,54,優(yōu)點(diǎn)：具有快速、靈敏、經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)，樣本無(wú)需凈化，縮短了檢測(cè)時(shí)間。 缺點(diǎn)：1)不能定性定量，只能作為對(duì)含有機(jī)磷農(nóng)藥和氨基甲酸酯農(nóng)藥殘毒的蔬菜進(jìn)行初篩的一種方法，將一部分含農(nóng)藥殘毒的蔬菜控制在市場(chǎng)之外。2) 不適宜檢測(cè)一些含辛辣物質(zhì)的蔬菜如蘿卜、韭菜以及一些如菱白、蘑菇等鹵類(lèi)蔬菜(含有破壞酶活性的物質(zhì))。3)對(duì)殘留量愈大的蔬菜，測(cè)定的誤差愈小。,55,假陽(yáng)性是由于酶活性降低或失活，底物不與之反應(yīng)，從而不能被水解，無(wú)法與顯色劑結(jié)合顯色。 假陰性是因?yàn)槟承┺r(nóng)藥對(duì)酶抑制作用很小或無(wú)作用而產(chǎn)生的，表現(xiàn)出無(wú)農(nóng)藥殘留的假象。 另外，在反應(yīng)過(guò)程中化學(xué)、物理干擾都有可能導(dǎo)致假陽(yáng)性、假陰性的發(fā)生。 靈敏度、重復(fù)性和回收率相對(duì)較差。 新方法：酶抑制-生物芯片分析法。,56,?由于此方法不能定性定量，所以當(dāng)測(cè)出有殘毒的蔬菜時(shí)，如果要作為仲裁處理，還應(yīng)該送往有關(guān)部門(mén)進(jìn)一步用氣相色譜等實(shí)驗(yàn)室儀器進(jìn)行定性和定量分析，其結(jié)果方可作為最終結(jié)論性數(shù)據(jù)。 2001年，農(nóng)藥速測(cè)卡法和農(nóng)藥殘留分光光度計(jì)法(抑制率法)被制定為國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)推薦分析方法，即《蔬菜中有機(jī)磷和氨基甲酸酯農(nóng)藥殘留量快速檢測(cè)方法》(GB/ T5009.199)，2002年公布實(shí)施。,57,,,58,三、化學(xué)方法1.農(nóng)藥多殘留掃描法(MRSM) 傳統(tǒng)的農(nóng)藥殘留分析，即樣本經(jīng)過(guò)提取、凈化后用氣相色譜、液相色譜等分析儀器進(jìn)行定性定量分析測(cè)定。傳統(tǒng)的化學(xué)分析儀器法花費(fèi)的時(shí)間長(zhǎng)。 農(nóng)藥多殘留方法是在一次分析中同時(shí)測(cè)定一種以上農(nóng)藥殘留的方法。,59,我國(guó)MRSM技術(shù)是1999年開(kāi)始推廣的一種對(duì)農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥多殘留快速掃描技術(shù)，簡(jiǎn)化了傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)的前處理，采用固相萃取，并使用氮吹儀代替常用的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器進(jìn)行濃縮，大大縮短了分析時(shí)間。 該法與上面介紹的快速測(cè)定方法的區(qū)別:(1)使用大型的儀器設(shè)備，如氣相色譜議和液相色譜儀，脫離不了實(shí)驗(yàn)室;(2)可以進(jìn)行農(nóng)藥殘留定性和定量分析;(3)可以進(jìn)行未知農(nóng)藥殘留的測(cè)定;(4)可檢測(cè)各類(lèi)蔬菜或水果樣本中四大類(lèi)(有機(jī)氯、有機(jī)磷、氨基甲酸酯、除蟲(chóng)菊酯類(lèi))的農(nóng)藥殘留;(5)對(duì)各類(lèi)農(nóng)藥?kù)`敏度均較高。作為仲裁依據(jù)；一種實(shí)驗(yàn)室快速檢測(cè)技術(shù)。,60,氮吹儀,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器,利用氮?dú)饬鲗⑷軇С鰳悠?，一般在加熱條件下進(jìn)行。,用于少量液體的濃縮，蒸汽壓較高的組分易損失。 不能用于酸、堿物質(zhì)的濃縮,61,,62,2.有機(jī)磷農(nóng)藥速測(cè)靈法(金屬離子催化顯色表面皿法) 原理是具有強(qiáng)催化作用的金屬離子催化劑、使各類(lèi)有機(jī)磷農(nóng)藥 (磷酸酯、二硫代酸酯、磷酰胺)在催化作用下水解為磷酸與醇，水解產(chǎn)物與顯色劑反應(yīng)，使顯色劑的紫紅色褪去變成無(wú)色。,63,,這種方法操作簡(jiǎn)便、價(jià)格便宜、檢測(cè)速度快，采用化學(xué)反應(yīng)原理，避免了通常所使用生化方法（酶法）的缺點(diǎn)（酶的制備、保存以及反應(yīng)需比較嚴(yán)格的條件），靈敏度也達(dá)到一定的要求。但主要針對(duì)的是有機(jī)磷農(nóng)藥的殘留檢測(cè)，特別是甲胺磷、對(duì)硫磷農(nóng)藥的定性檢測(cè)。 操作簡(jiǎn)便、價(jià)廉、檢測(cè)速度快，但是容易受到植物組織液、葉綠體干擾，故只能用于檢測(cè)葉片、果品表面的農(nóng)藥殘留。,64,第二節(jié) 獸藥殘留的快速檢測(cè),一、傳統(tǒng)微生物抑制試驗(yàn)(MIT) ?獸藥殘留（residues of veterinary drugs）指動(dòng)物用藥后，任何可食動(dòng)物源性產(chǎn)品中所含有的原型藥物或/和其代謝產(chǎn)物，以及與獸藥有關(guān)雜質(zhì)的殘留。,65,,最大殘留限量（maximum residue limit, MRL）：食品動(dòng)物用藥后，允許存在食物表面或內(nèi)部的該獸藥殘留的最高量/濃度（以鮮重計(jì)，表示為mg/kg或μg/kg）,66,,分析大量樣品中抗生素的殘留物通常采用MIT法。這些方法是建立在活性藥物抑制微生物生長(zhǎng)能力的基礎(chǔ)上。 通用的抑制試驗(yàn)是圓盤(pán)檢驗(yàn)技術(shù)。將樣品提取液點(diǎn)在接種有試驗(yàn)菌的瓊脂上，培養(yǎng)后可測(cè)定抗菌藥物形成的抑菌圈。抑菌圈表明抗生素的存在，而圈的大小則與抗生素的濃度有關(guān)。,67,嗜熱脂肪芽孢桿菌紙片法。國(guó)際上公認(rèn)并作為法定檢測(cè)食品中抗生素殘留的方法首推嗜熱脂肪芽孢桿菌紙片法。 利用抗生素培養(yǎng)基接種嗜熱脂肪芽胞桿菌芽胞，把接種培養(yǎng)基6ml倒入各個(gè)15mm×100mm的培養(yǎng)皿中(平皿需于7天內(nèi)使用)，紙片直徑12.7mm浸漬奶樣，放于瓊脂中，把平皿于64℃培養(yǎng)2小時(shí)或55℃培養(yǎng)4 小時(shí)，培養(yǎng)結(jié)束，用毫米游標(biāo)尺測(cè)量抑菌圈直徑，陽(yáng)性結(jié)果以≥16mm為準(zhǔn)。 本法可進(jìn)行定量測(cè)定，1981年由FDA認(rèn)可，1982年1月1日起生效為法定方法。,68,,69,此法有6項(xiàng)優(yōu)點(diǎn): ①用嗜熱脂肪芽孢桿菌芽孢懸浮物代替藤黃八迭球菌過(guò)夜肉湯培養(yǎng)物做試驗(yàn)菌，故性質(zhì)更穩(wěn)定，貯存時(shí)間更長(zhǎng)，可達(dá)5-8個(gè)月; ②檢測(cè)敏感度高，能檢出牛奶中青霉素G含量為0.005U/mL; ③方法簡(jiǎn)便、快速、省錢(qián)，2-4h可出現(xiàn)抑菌圈; ④不僅能檢測(cè)青霉素G，還能檢測(cè)其他多種常用抗生素如氨芐青霉素、氯青霉素和四環(huán)素等。 ⑤可作定量測(cè)定; ⑥不受消毒劑干擾。,70,TTC 法是目前我國(guó)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的檢測(cè)牛奶中抗生素殘留的檢測(cè)方法。 原理：細(xì)菌生物氧化有方式，即加氧、脫氧和脫電子，相反即還原。當(dāng)乳中加入嗜熱鏈球菌后，如乳中無(wú)抗生素，嗜熱鏈球菌就生長(zhǎng)繁殖，在新陳代謝過(guò)程中進(jìn)行生物氧化，其中脫出的氫可以和加在乳中的氧化型TTC結(jié)合而成為還原型TTC，氧化型TTC是無(wú)色的，還原型TTC是紅色，所以可使乳變紅色為陰性。相反，如乳中存在抗生素，嗜熱鏈球菌就不能生長(zhǎng)繁殖，沒(méi)有氫釋放，TTC也不能被還原仍為無(wú)色，被檢樣保持鮮乳的顏色，即為陽(yáng)性。,二、氯化三苯四氮唑法(TTC),71,TTC 法能檢出牛奶中青霉素含為0.004U/mL。 日本20世紀(jì)50年代TTC法是檢測(cè)牛奶中青霉素殘留的法定方法。 該方法1955年4月1日起在我國(guó)生效為法定方法。,72,三、酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定(ELlSA),? ELlSA測(cè)定法是根據(jù)酶標(biāo)記的抗體或抗抗體來(lái)進(jìn)行的抗原—抗體反應(yīng)。 由于酶的專(zhuān)一性催化作用，可使原來(lái)無(wú)色的底物通過(guò)水解，氧化或還原反應(yīng)而顯示顏色。,73,市面上有關(guān)歐美針對(duì)抗生素殘留檢測(cè)的商品化ELISA試劑盒有許多。 英國(guó)Randox公司ELISA試劑盒已獲AOAC認(rèn)可。 2001年12月21日國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局推薦英國(guó)Randox公司的ELISA試劑盒作為動(dòng)物激素、抗生素殘留的首選篩選試劑。,74,四、放射免疫測(cè)定法,RIA測(cè)定就是應(yīng)用放射性物質(zhì)代替ELISA中的標(biāo)記酶作為抗體的偶聯(lián)物，在食品安全快速檢測(cè)中最常見(jiàn)的同位素是6H和14C。 1978年charm氏在RIA技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展了放射免疫受體檢測(cè)技術(shù)(RRA)。,75,RRA在檢測(cè)食品中抗生素殘留的原理： (1)每類(lèi)抗生素族均是在一個(gè)母環(huán)基礎(chǔ)上用不同功能團(tuán)修飾形成特定功效的抗生素。 (2)微生物細(xì)胞表面都存在著能與各種抗生素功能基團(tuán)結(jié)合的特異受點(diǎn)(這種高度的專(zhuān)一性類(lèi)似于抗原和抗體間的專(zhuān)一性)。,76,,抗生素抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的能力是由微生物特定位上的附著決定的，并由此打斷該細(xì)菌的代謝活動(dòng)。 結(jié)合反應(yīng)是在標(biāo)記的靶參考物(示蹤物)與無(wú)標(biāo)記的待測(cè)藥物(非標(biāo)記物)之間競(jìng)爭(zhēng)進(jìn)行的。測(cè)試建立在藥物的功能團(tuán)和微生物細(xì)胞專(zhuān)一性受點(diǎn)的結(jié)合反應(yīng)的基礎(chǔ)上。,77,此方法將細(xì)胞上具有特異性受體點(diǎn)的細(xì)菌加到含有6H或14C標(biāo)記藥物的牛奶或組織提取物中，這些加放射標(biāo)記的藥物與樣品中所含的藥物殘留物競(jìng)爭(zhēng)可利用的細(xì)胞受體部位，樣品經(jīng)離心除去上清液，沉淀在β-閃爍液重新懸浮，用液體閃爍計(jì)數(shù)器來(lái)測(cè)量其放射性。 牛奶、血清、雞蛋、組織中的檢測(cè)限在低于10-6范圍內(nèi)。,78,在現(xiàn)有的放射性檢疫檢測(cè)方法中，作為快速檢測(cè)方面最成功的例子，是CharmⅡ6600/7600抗生素快速檢測(cè)系統(tǒng)。 該檢測(cè)系統(tǒng)可以檢測(cè)動(dòng)物和魚(yú)類(lèi)的肌肉組織、蛋類(lèi)、飼料、蜂蜜、水、水果、蔬菜、谷物等樣品。 目前CharmⅡ7600檢測(cè)系統(tǒng)就β-內(nèi)酰胺、 氯霉素類(lèi)、氨基糖苷類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)、磺胺類(lèi)、鄰氯青霉素及堿性磷酸酶這六項(xiàng)檢測(cè)已被FDA認(rèn)可。,79,五、磺胺二甲基嘧啶快速測(cè)定,??磺胺藥物廣泛的用作為飼料添加劑，因此殘留可能發(fā)生在動(dòng)物源性食品中，例如牛奶和肉類(lèi)中。特別是致癌性的磺胺二甲基嘧啶給人類(lèi)的健康帶來(lái)了威脅。 對(duì)于磺胺二甲基嘧啶殘留的檢測(cè)，由于微生物抑制分析方法缺乏靈敏度和特異性。 高相液相色譜是最常采用的方法。然而HPLC方法的缺點(diǎn)是制備樣品要耗費(fèi)大量時(shí)間、并且需要昂貴的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備。 酶標(biāo)免疫分析定量測(cè)定磺胺二甲基嘧啶殘留方法適于日常大量樣品的篩選，特別是近年發(fā)展的試劑盒為快速篩選提供了途徑。。,80,酶標(biāo)免疫分析定量測(cè)定磺胺二甲基嘧啶殘留方法適于日常大量樣品的篩選，特別是近年發(fā)展的試劑盒為快速篩選提供了途徑。 競(jìng)爭(zhēng)酶標(biāo)免疫法可以定性和定量測(cè)定牛奶、肉類(lèi)及腎臟中的磺胺二甲基嘧啶殘留。,81,操作步驟：,微孔板包被有針對(duì)兔IgG(磺胺二甲基嘧啶抗體)的羊抗體。加入磺胺二甲基嘧啶抗體，磺胺二甲基嘧啶酶標(biāo)記物，標(biāo)準(zhǔn)或樣品溶液。游離磺胺二甲基嘧啶與磺胺二甲基嘧啶密酶標(biāo)記物競(jìng)爭(zhēng)磺胺二甲基嘧啶抗體，同時(shí)磺胺二甲基嘧啶抗體與羊抗體連接。沒(méi)有連接的酶標(biāo)記物在洗滌步驟中被除去。將酶基質(zhì)(過(guò)氧化尿素)和發(fā)色劑(四甲基聯(lián)苯胺)加入到孔中并且孵育。結(jié)合的酶標(biāo)記物將無(wú)色的發(fā)色劑轉(zhuǎn)化為收色的產(chǎn)物。加入反應(yīng)停止液后使顏色為藍(lán)轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色。在450nm處測(cè)量，吸收光強(qiáng)度與樣品中的磺胺二甲基嘧啶濃度成反比。,82,RIDASCREEN磺胺二甲基嘧啶試劑盒的平均檢測(cè)下限約為1μg/kg。根據(jù)樣品處理記錄，在牛奶中磺胺二甲基嘧啶的檢測(cè)下限為10μg/kg（10ppb）,在肉類(lèi)及腎臟中磺胺二甲基嘧啶的檢測(cè)下限為2μg/kg( 2ppb)， 蜂蜜中磺胺二甲基嘧啶的檢測(cè)下限為1μg/kg(1ppb)。,磺胺總量試劑盒是競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫法，定量檢測(cè)蛋、肉（雞肉和豬肉）、魚(yú)、蝦、蜂蜜和奶類(lèi)樣品中的磺胺類(lèi)藥物總量。,83,快速、高通量獸藥殘留檢測(cè)系統(tǒng),生物芯片法 英國(guó)Randox公司evidence investigator系統(tǒng)：是以生物芯片技術(shù)為核心，集合免疫學(xué)原理和高靈敏的化學(xué)發(fā)光技術(shù)，通過(guò)對(duì)單個(gè)微量樣品進(jìn)行多種檢測(cè)項(xiàng)目組合的定量檢測(cè)，提供高通量、高精度的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。快速出報(bào)告：這是目前世界上最快的分析系統(tǒng)，可在2小時(shí)內(nèi)完成對(duì)540個(gè)樣品的分析，每個(gè)樣品的檢測(cè)項(xiàng)目達(dá)6-12種； 真正實(shí)現(xiàn)多通道檢測(cè)：一次可檢測(cè)54個(gè)樣品，每個(gè)樣品可同時(shí)檢測(cè)6-12種成分；,84,六、鹽酸克倫特羅快速測(cè)定,1.簡(jiǎn)介 瘦肉精學(xué)名為鹽酸克倫特羅。鹽酸克倫特羅為克倫特羅的鹽酸鹽形式，用于藥名又稱(chēng)克喘素。 它屬于β-腎上腺素類(lèi)激動(dòng)劑類(lèi)，是一種交感神經(jīng)末梢的介質(zhì)?？稍鰪?qiáng)代謝、加快心跳和增強(qiáng)血管收縮和擴(kuò)張氣管，臨床上用于治療哮喘。,瘦肉精,85,上世紀(jì)80年代初，美國(guó)脂胺公司研究人員意外地發(fā)現(xiàn)，將一定量的鹽酸克倫特羅加入飼料中，能夠改變營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝途徑，促進(jìn)動(dòng)物肌肉特別是骨胳肌蛋白質(zhì)的合成，同時(shí)抑制脂肪合成，從而促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，增加瘦肉率。根據(jù)試驗(yàn)得出，在飼料中添加適量的鹽酸克倫特羅，可以提高飼料轉(zhuǎn)化率、生長(zhǎng)速率、瘦肉相對(duì)增加10％以上，于是這項(xiàng)技術(shù)開(kāi)始在養(yǎng)殖業(yè)中大行其道。,瘦肉精用于養(yǎng)殖的發(fā)現(xiàn),,86,作用機(jī)理,,它的主要作用機(jī)理是作為一種強(qiáng)效激動(dòng)劑，選擇性的作用于腎上腺素β2受體上，激活腺苷酸環(huán)化酶(cAMP)，使環(huán)磷腺苷增加，加強(qiáng)脂肪分解，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，實(shí)現(xiàn)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)再分配，故又將瘦肉精稱(chēng)作“生長(zhǎng)促進(jìn)劑(growth promoter)”和營(yíng)養(yǎng)“重分配劑(repartitioning agent)”。,87,2.痩肉精危害,,,可增強(qiáng)脂肪代謝，減慢蛋白質(zhì)分解代謝，可顯著提高飼料轉(zhuǎn)化率和瘦肉率。 瘦肉精性狀穩(wěn)定，加熱到172℃以上分解，一般的家庭烹飪很難去毒。 中毒臨床表現(xiàn)有：心跳過(guò)速、心慌、精神緊張、肌肉震顫、肌肉疼痛、頭疼、暈眩等。若長(zhǎng)期食用，有可能導(dǎo)致染色體畸變，誘發(fā)惡性腫瘤。 有心臟病、高血壓、甲亢等患者可能食用后會(huì)有生命危險(xiǎn)。,88,2001年8月22日，廣東信宜市510人因食用殘留鹽酸克倫特羅的豬肉而中毒，其中51人出現(xiàn)嚴(yán)重的中毒現(xiàn)象。 11月7日廣東省河源市484人，也都因食用含有鹽酸克倫特羅的豬肉或豬肝而中毒。,動(dòng)物性食品中毒案例,,89,但當(dāng)前瘦肉精卻屢禁不止，原因之一就是國(guó)內(nèi)外檢測(cè)CLB的方法手段還不夠完善，還沒(méi)有建立宰前監(jiān)測(cè)體系和準(zhǔn)確迅速方便精確的檢測(cè)方法，從而使不法分子有機(jī)可乘。,當(dāng)前現(xiàn)狀,,90,鹽酸克倫特羅一般使用HPLC或GC-MS進(jìn)行測(cè)定，但是其前處理步驟繁瑣且費(fèi)用昂貴。 鹽酸克倫特羅測(cè)定試劑盒則是一種有用的篩選方法，可用在檢測(cè)尿、肌肉、肝臟等的鹽酸克倫特羅殘留。 RIDASCREEN Clenbuterol Fast(克倫特羅測(cè)定試劑盒)是非常有用的篩選方法。競(jìng)爭(zhēng)酶標(biāo)免疫法定量測(cè)定尿、肌肉、肝臟及牛眼中的克倫特羅（Clenbuterol）。,91,測(cè)定原理,測(cè)定的基礎(chǔ)是抗原抗體反應(yīng)。微孔板包被有針對(duì)兔IgG（克倫特羅抗體）的羊抗體?？藗愄亓_抗體被加入，經(jīng)過(guò)孵育及洗滌步驟后，加入克倫特羅酶標(biāo)記物，標(biāo)準(zhǔn)或樣品溶液。克倫特羅與克倫特羅酶標(biāo)記物競(jìng)爭(zhēng)克倫特羅抗體，沒(méi)有連接的克倫特羅酶標(biāo)記物在洗滌步驟中被除去。將酶基質(zhì)（過(guò)氧化尿素）和發(fā)色劑（四甲基聯(lián)苯胺）加入到孔中并且孵育。結(jié)合的酶標(biāo)記物將無(wú)色的發(fā)色劑轉(zhuǎn)化為藍(lán)色的產(chǎn)物。加入反應(yīng)停止液后使顏色由藍(lán)轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色。在450nm處測(cè)量，吸收光強(qiáng)度與樣品中的克倫特羅濃度成反比。,,,92,,,一般含鹽酸克倫特羅的豬肉色特別鮮紅，脂肪非常薄，肉皮緊貼著瘦肉，瘦肉纖維比較疏松，肉皮與瘦肉之間幾乎無(wú)肥肉( 肥膘厚度不到1.5cm) 一般健康肉淡紅色肉質(zhì)彈性好通過(guò)這種感官識(shí)別方法就可以快速簡(jiǎn)單定性對(duì)動(dòng)物性食品中有無(wú)CLB作出初步判定。缺點(diǎn)：只是一種經(jīng)驗(yàn)的判斷，不夠準(zhǔn)確,感官識(shí)別,,93,第三節(jié) 真菌毒素及化學(xué)污染物的 快速檢測(cè),一、食品中真菌毒素的快速測(cè)定 真菌及真菌毒素污染食品后，引起的危害： 真菌引起食品變質(zhì)真菌產(chǎn)生的毒素引起的中毒,94,,真菌毒素的快速分析方法主要有： 親和色譜法 酶聯(lián)免疫吸附法,95,親和色譜法是利用生物分子間所具有的專(zhuān)一親和力而設(shè)計(jì)的層析技術(shù)。 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)是一種將抗原抗體免疫反應(yīng)的特異性和酶的高效催化作用有機(jī)地結(jié)合起來(lái)用于檢測(cè)的免疫技術(shù)。--既可用于檢測(cè)抗原，又可檢測(cè)抗體，ELISA法可進(jìn)行定性和定量測(cè)定。,96,1.黃曲霉毒素快速分析技術(shù) 黃曲霉毒素是主要由黃曲霉 (aspergillus flavus) 寄生曲霉 (a.parasiticus) 產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，在濕熱地區(qū)食品和飼料中出現(xiàn)黃曲霉毒素的機(jī)率最高。 黃曲霉毒素的相對(duì)分子量為312-346。難溶于水,易溶于油,甲醇,丙酮和氯仿等有機(jī)溶劑,但不溶于石油醚,己烷和乙醚中。一般在中性溶液中較穩(wěn)定,但在強(qiáng)酸性溶液中稍有分解,在pH9-10的強(qiáng)堿溶液中分解迅速。其純品為無(wú)色結(jié)晶,耐高溫,黃曲霉毒素B1的分解溫度為268℃,97,,1993年黃曲霉毒素被食品衛(wèi)生組織(WHO)的癌癥研究機(jī)構(gòu)劃定為1類(lèi)致癌物,是一種毒性極強(qiáng)的劇毒物質(zhì)，其毒性相當(dāng) 氰化鉀的10倍，砒霜的68倍。 黃曲霉毒素屬肝臟毒，抑肝臟蛋白質(zhì)的合成，引發(fā)不同類(lèi)型的肝臟疾病。嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致肝癌甚至死亡。 在天然污染的食品中以黃曲霉毒素B1最為多見(jiàn),其毒性和致癌性也最強(qiáng)。,98,黃曲霉毒素的種類(lèi)和結(jié)構(gòu) 目前已發(fā)現(xiàn)的黃曲霉毒素相關(guān)化合物有B1、B2、G1、G2、B2a、G2a、M1、M2、P1等十二種左右 。 基本結(jié)構(gòu)都是二氫呋喃氧雜萘鄰?fù)难苌?，即結(jié)構(gòu)中含有一個(gè)二 呋喃環(huán)和一個(gè)氧雜萘鄰?fù)?香豆素)。前者為基本毒性結(jié)構(gòu)，后者與致癌有關(guān)。M1是黃曲霉毒素B1在體內(nèi)經(jīng)過(guò)羥化而衍生成的代謝產(chǎn)物。黃曲霉毒素的主要分子型式含 B1、B2、G1、G2 ，M1、M2等。其中M1和M2 主要存在于牛奶中。B1為毒性及致癌性最強(qiáng)的物質(zhì)。 B1和G1的二呋喃環(huán)末端有雙鍵。二呋喃環(huán)末端有雙鍵者毒性較強(qiáng)并有致癌性。其中B1毒性及致癌性最強(qiáng)。 B1在食品中的污染最廣泛，對(duì)食品的安全性影響最大，在食品衛(wèi)生監(jiān)測(cè)中，以它作為污染指標(biāo)。,99,,各種黃曲霉毒素的結(jié)構(gòu),100,（1）免疫親和柱法,原理：試樣中的黃曲霉毒素用一定比例的甲醇/水提取液經(jīng)過(guò)過(guò)濾，稀釋后，用免疫親和柱凈化，以甲醇將親和柱上的黃曲霉毒素淋洗下來(lái)，在淋洗液中加入溴溶液衍生，以提高測(cè)定靈敏度，然后用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行定量；也可以將甲醇-黃曲霉毒素淋洗液的一部分注入HPLC中，對(duì)黃曲霉毒素B1,B2,G1,B2分別進(jìn)行定量分析。免疫親和柱是用大劑量的黃曲霉毒素單克隆抗體固化在水不溶性的載體上，然后裝柱而成。該方法的測(cè)定范圍0-300ug/kg。,101,黃曲霉毒素免疫親和柱-熒光光度計(jì)法克服了TLC和HPLC法在操作過(guò)程中使用劇毒的黃曲霉毒素作為標(biāo)定標(biāo)準(zhǔn)物，極少使用有機(jī)溶劑，操作方便，耗時(shí)少。一個(gè)樣品只需10-15min,比傳統(tǒng)方法快幾個(gè)小時(shí)甚至幾天時(shí)間;儀器設(shè)備輕便容易攜帶,自動(dòng)化程度高 ,操作簡(jiǎn)單,直接讀出測(cè)試結(jié)果,可以在小型實(shí)驗(yàn)或現(xiàn)場(chǎng)使用?？梢赃M(jìn)行黃曲霉毒素總量 (B1B2G1G2) 的測(cè)定,檢測(cè)限可達(dá)到1ug/kg,達(dá)到黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)限量值以下測(cè)定范圍為1-300ug/kg.,102,免疫親和柱—熒光分光光度法,1.程序試樣經(jīng)過(guò)甲醇—水提取，提取液經(jīng)過(guò)濾、稀釋后，濾液經(jīng)過(guò)含有黃曲霉毒素特異抗體的免疫親和層析凈化，此抗體對(duì)黃曲霉毒素 B1、B2、G1、G2具有專(zhuān)一性，黃曲霉毒素交聯(lián)在層析介質(zhì)中的抗體上。用水將免疫親和柱上雜質(zhì)除去，以甲醇通過(guò)免疫親和層析柱洗脫，加入溴溶液衍生，以提高測(cè)定靈敏度。洗脫液通過(guò)熒光光度計(jì)測(cè)定黃曲霉毒素(B1、B2、G1、G2)總量。,103,2.分析步驟,(1)提取大米、玉米、小麥、花生及其制品:準(zhǔn)確稱(chēng)取經(jīng)過(guò)磨細(xì)(粒度小于 2 mm)的試樣 25. 0 g于250 mL具塞錐形瓶中，加入 5. 0 g氯化鈉及甲醇一水(7+3)至 125.0 mL(V1)，以均質(zhì)器高速攪拌提取2 min。定量濾紙過(guò)濾，準(zhǔn)確移取 15.0 mL(V2)濾液并加入 30.0 mL(V3)水稀釋?zhuān)貌ＡЮw維濾紙過(guò)濾1-2次，至濾液澄清，備用。植物油脂:準(zhǔn)確稱(chēng)取試樣 25. 0 g于 250 mL具塞錐形瓶中，加人 5.0 g氯化鈉及加入甲醇一水(7+3)至 125.0 mL(V1)，以均質(zhì)器高速攪拌提取 2 min。定量濾紙過(guò)濾，準(zhǔn)確移取 15.0 mL(V2)濾液并加入 30. 0 mL(V3)水稀釋?zhuān)貌ＡЮw維濾紙過(guò)濾 1-2次，至濾液澄清，備用。,104,(2)凈化1) 大米、玉米、小麥、花生及其制品、植物油脂:將免疫親和柱連接于 20.0 mL玻璃注射器下。準(zhǔn)確移取 15.0 mL(V4)樣品提取液注入玻璃注射器中，將空氣壓力泵與玻璃注射器連接，調(diào)節(jié)壓力使溶液以約 6 mL/min流速緩慢通過(guò)免疫親和柱，直至 2 mL-3 mL空氣通過(guò)柱體。以10 mL水淋洗柱子兩次，棄去全部流出液，并使 2 mL-3 mL空氣通過(guò)柱體。準(zhǔn)確加入 1.0 mL(V)色譜級(jí)甲醇洗脫，流速為 1 mL/min-2 mL/min，收集全部洗脫液于玻璃試管中，供檢測(cè)用。,105,(3)測(cè)定,1)熒光光度計(jì)校準(zhǔn)在激發(fā)波長(zhǎng) 360 nm，發(fā)射波長(zhǎng)450 nm 條件下，以0.05 mol/L硫酸溶液為空白，調(diào)節(jié)熒光光度計(jì)的讀數(shù)值為 0.0μg/L;以熒光光度計(jì)校準(zhǔn)溶液調(diào)節(jié)熒光光度計(jì)的讀數(shù)值為 20.0 μg/L。 2)樣液測(cè)定取上述凈化后的甲醇洗脫液加入1.0 mL 0.002 %溴溶液，混勻，靜置1 min，按上述條件進(jìn)行操作，于熒光光度計(jì)中讀取樣液中黃曲霉毒素B1+B2+G1+G2)的濃度C(μg/L)。 3) 空白試驗(yàn)用水代替試樣，按提取和凈化步驟做空白試驗(yàn)。 4) 結(jié)果計(jì)算,106,酶聯(lián)免疫吸附劑（ELISA）試劑盒是依據(jù)GB/T5009.22-2003第二法的原理制成的，測(cè)定的實(shí)質(zhì)是采用酶標(biāo)記的抗體或抗原與樣品中的抗原或抗體間進(jìn)行的抗原—抗體反應(yīng)，加入顯色液后，通過(guò)目測(cè)觀察顏色來(lái)做快速的半定量的結(jié)果分析。測(cè)定原理：樣品中的AFTB1經(jīng)提取、脫脂、濃縮后與定量的特異性抗體（抗黃曲霉毒素 B1單克隆抗體）反應(yīng)，多余的游離抗體則與酶標(biāo)板內(nèi)的包被抗原（AFB1-BSA人工抗原）結(jié)合，加入酶標(biāo)記物和底物后顯色，與標(biāo)準(zhǔn)比較測(cè)定含量。,（2）酶聯(lián)免疫吸附劑（ELISA）,107,所用抗原抗體：抗體：抗黃曲霉毒素B1的單克隆抗體（或抗血清）包被抗原：黃曲霉毒素B1與載體蛋白（牛血清蛋白）的結(jié)合物酶標(biāo)二抗：羊抗鼠IgG與辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合物,108,測(cè)定步驟： 1.樣品中AFB1的提取,(1)大米和小麥（脂肪含量＜3.0％）：樣品粉碎后過(guò)20目篩，稱(chēng)取20.0g，加入250m1具塞錐形瓶中。準(zhǔn)確加入60mL三氯甲烷，蓋塞后滴水封嚴(yán)，150rpm振蕩30min。靜置后，用快速定性濾紙過(guò)濾于50mL燒杯中，立即取12mL濾液（相當(dāng)4.0g樣品）于75mL蒸發(fā)皿中。65℃水浴通風(fēng)揮干。用2.0mL甲醇一PBS (20+80)分三次（0.8mL、0.7mL、0.5mL）溶解并徹底沖洗蒸發(fā)皿中凝結(jié)物，移至小試管加蓋振蕩后靜置待測(cè)。此液每毫升相當(dāng)2.0g樣品。,109,(2)玉米（脂肪含量3.0～5.0％）：樣品粉碎后過(guò)20目篩，稱(chēng)取20.0g，加入250mL具塞錐形瓶中。準(zhǔn)確加入50.0mL甲醇一水（80+20）溶液和15.0mL石油醚，蓋塞后滴水封嚴(yán)，150rpm振蕩30min。用快速定性濾紙過(guò)濾于125mL分液漏斗中,待分層后，放出下層甲醇水溶液于50mL燒杯內(nèi)，從中取10.0mL （相當(dāng)于4.0g樣品）于75mL蒸發(fā)皿中,以下按上述“65℃水浴通風(fēng)揮干”起，依法操作。,110,(3)花生（脂肪含量15.0-45.0％）：樣品去殼去皮粉碎后稱(chēng)取20.0g，加入250mL具塞三角瓶中，準(zhǔn)確加入100.0mL甲醇水(55 ＋45）溶液和30mL石油醚,蓋塞后滴水封嚴(yán)，150rpm振蕩30min，靜置15min后用快速定性濾紙過(guò)濾于125mL分液漏斗中，待分層后，放出下層甲醇水溶液于100mL燒杯內(nèi)，從中取20.0 mL（相當(dāng)于4.0g樣品）置于另一125mL分液漏斗中，加入20.0mL三氯甲烷，振搖2min，靜置分層（如有乳化現(xiàn)象可滴加甲醇促使分層）。放出三氯甲烷于75mL蒸發(fā)皿中，再加5.0mL三氯甲烷于分液漏斗中重復(fù)振搖提取后，放出三氯甲烷層一并于蒸發(fā)皿中，以下按上述“65℃水浴通風(fēng)揮干”起，依法操作。,111,(4)植物油：用小燒杯稱(chēng)取4.0g樣品，用20.0mL石油醚，將樣品移于125mL分液漏斗中，用20.0mL 甲醇水(55 ＋45）溶液分次洗燒杯，溶液一并移人分液漏斗中。（精煉油4.0g樣為4.575mL，可直接用移液器加入分液漏斗再加溶劑后振搖）振搖2min，靜置分層后，放出下層甲醇水溶液于750mL蒸發(fā)皿中。再用5.0mL甲醇水溶液重復(fù)振搖提取一次，提取液一并加入蒸發(fā)皿中，以下按自“65℃水浴通風(fēng)揮干”起，依法操作。(5)其它食品：可按照GB5009有關(guān)章節(jié)提供的方法操作，最終提取物（相當(dāng)于4.0g樣品）應(yīng)收集于2.0m1甲醇一PBS(20＋80)中。,112,2.間接競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA),(1)包被微孔板： 用AFB1-BSA人工抗原包被酶標(biāo)板，100μL/孔，4℃過(guò)夜。 (3)封閉：已包被的酶標(biāo)板用洗液洗3次，每次3min后，加封閉液封閉，250μL/孔，置37℃下1h。,113,(3)抗體抗原反應(yīng)：將黃曲霉毒素B1純化單克隆抗體稀釋倍后分別 a.與等量不同濃度的黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液用2mL試管混合振蕩后，4℃靜置。此液用于制作黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線。 b.與等量樣品提取液用2mL試管混合振蕩后，4℃靜置。此液用于測(cè)定樣品中黃曲霉毒素B1含量。酶標(biāo)板洗3×3min后，加抗體抗原反應(yīng)液，以抗體稀釋液為陰性對(duì)照，空白對(duì)照，130μL/孔 ，37℃，2h。,114,(4)酶標(biāo)記反應(yīng)：酶標(biāo)板洗3×3min，加酶標(biāo)二抗(1∶200，V/V)100μL/孔，1h。 (5)顯色反應(yīng)： 酶標(biāo)板用洗液洗5×3min。加底物溶液(10mgOPD)加25mL底物緩沖液加37μL30%H2O2，100μL/孔，37℃，15min。 (6)終止：加2mol/LH2SO4，40μL/孔，以終止顯色反應(yīng)。 (7)測(cè)定：酶標(biāo)儀490nm測(cè)出OD值。,115,3.數(shù)據(jù)處理及計(jì)算結(jié)果,(1)求出各孔的0D校正值：0D校正值＝OD實(shí)測(cè)值一空白對(duì)照孔0D值（均值）。(2)求出待測(cè)樣的0D％值：0D％＝[OD校正值/陰性對(duì)照孔0D校正值（均值）］× 100％。(3)求出待測(cè)樣AFB1含量（ng／g）：在標(biāo)準(zhǔn)競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線上找到待測(cè)樣0D％值（座標(biāo)Y值）的對(duì)應(yīng)點(diǎn)，該點(diǎn)座標(biāo)X值的反對(duì)數(shù)（10x）即為樣品中AFB1的含量（ng／g）,116,免疫親和柱法和酶聯(lián)免疫吸附法雖然都可達(dá)到快速簡(jiǎn)便效果,但酶聯(lián)免疫吸附法僅能檢測(cè)單一毒素(如黃曲霉毒素B1)含量,而且易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果,難以控制。免疫親和柱法(包括熒光光度法和HPLC法)卻能達(dá)到既定量準(zhǔn)確又快速簡(jiǎn)便的要求。,117,（3）金標(biāo)試紙法,利用競(jìng)爭(zhēng)性免疫分析原理設(shè)計(jì)。 ?氯金酸在還原劑作用下，可聚合成一定大小的金顆粒，形成帶負(fù)電的疏水膠溶液。由于靜電作用而成為穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，故稱(chēng)膠體金。 膠體金標(biāo)記，實(shí)質(zhì)上是蛋白質(zhì)等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過(guò)程。,118,,膠體金檢測(cè)條在臨床診斷中廣泛使用。方法成熟，使用簡(jiǎn)便。 關(guān)鍵是制備單克隆抗體，然后與膠體金交聯(lián)，在親水紙層析條上固定。,119,檢測(cè)原理:將特異性的抗原或抗體以條帶狀固定在膜上，膠體金標(biāo)記試劑（抗體或單克隆抗體）吸附在結(jié)合墊上，當(dāng)待檢樣本加到試紙條一端的樣本墊上后，通過(guò)毛細(xì)作用向前移動(dòng)，溶解結(jié)合墊上的膠體金標(biāo)記試劑后相互反應(yīng)，再移動(dòng)至固定的抗原或抗體的區(qū)域時(shí)，待檢物與金標(biāo)試劑的結(jié)合物又與之發(fā)生特異性結(jié)合而被截留，聚集在檢測(cè)帶上，可通過(guò)肉眼觀察到顯色結(jié)果。,120,,試紙條由樣品墊、金標(biāo)墊、硝酸纖維膜和樣品吸收墊四部分組成(下圖)。,121,操作流程：,122,A：陰性。對(duì)照線(C)和測(cè)試線(T)同時(shí)存在，表明樣品中無(wú)黃曲霉毒素。 B：陽(yáng)性。只有對(duì)照線(C)，無(wú)樣品測(cè)試線(T)。表明樣品中含有高濃度的黃曲霉毒素。 C：無(wú)效結(jié)果。對(duì)照線(C)和測(cè)試線(T)都不存在。,A：陰性,B：陽(yáng)性,C 無(wú)效結(jié)果,樣品處理,比色,,123,,該方法是利用單克隆抗體而設(shè)計(jì)的固相免疫分析法。由此產(chǎn)生的一步式AFT快速檢測(cè)紙法可在5-10 min完成對(duì)樣品中AFT的定性測(cè)定。借助AFT標(biāo)準(zhǔn)樣品，能估算AFT的含量，非常適用于現(xiàn)場(chǎng)測(cè)試和進(jìn)行大量樣品時(shí)初選，實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)的目的。,124,2.黃曲霉毒素M1快速測(cè)定技術(shù) ?黃曲霉毒素M1，是動(dòng)物攝入黃曲霉毒素B1后在體內(nèi)經(jīng)經(jīng)基化代謝的產(chǎn)物，黃曲霉毒素M1的毒性和致癌性與黃曲霉毒素B1的基本相似。 快速測(cè)定法： 免疫親和柱凈化 一熒光計(jì)測(cè)定法。 免疫親和柱凈化一高效液相色譜法。,125,(1)免疫親和柱凈化一熒光計(jì)快速測(cè)定法 試樣經(jīng)過(guò)離心、脫脂、過(guò)柱后，濾液經(jīng)過(guò)結(jié)合有黃曲霉毒素M1特殊抗體的免疫親和柱凈化，此抗體對(duì)黃曲霉毒素M1有專(zhuān)一識(shí)別能力，黃曲霉毒素M1鍵合在分離柱中的抗體。用甲醇-水(10：90)將免疫親和柱上雜質(zhì)除去，以甲醇-水(80:20)通過(guò)分離柱洗脫，加入溴溶液衍生，以提高測(cè)定靈敏度。衍生化后的洗脫液于熒光光度計(jì)中測(cè)定黃曲霉毒素M1。,126,①適用于測(cè)定牛奶、奶粉，以及低脂牛奶、脫脂牛奶、黃曲霉毒素M1的含量。奶粉中的最低檢測(cè)限是0.08μg/kg ，牛奶中的最低檢測(cè)限是0.008μg/kg。,127,②試樣通過(guò)免疫親和柱時(shí)，黃曲霉毒素M1被提取，親和在固體支持物上。當(dāng)樣品通過(guò)親和柱時(shí)，抗體選擇性地與所有存在的黃曲霉毒素抗原結(jié)合，形成抗體-抗原復(fù)合體。用淋洗液將親和柱上的黃曲霉毒素M1洗脫下來(lái)，收集洗脫液。用液相色譜儀(HPLC)測(cè)定洗脫液中黃曲霉毒素M1含量。,128,赭曲霉毒素的檢測(cè)方法包括:酶聯(lián)免疫吸附法薄層色譜法HPLC免疫親和柱-熒光法免疫親和柱-HPLC法等。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法有直接法和間接法。,3.赭曲霉毒素快速檢測(cè)技術(shù),129,伏馬菌素的檢測(cè)方法主要有: 免疫親和柱 免疫親和-HPLC法 毛電泳電泳法 液相-質(zhì)譜法,4.伏馬菌素的快速檢測(cè),南非與中國(guó)某些地區(qū)食管癌高發(fā)與吃此類(lèi)毒素污染的玉米有關(guān),130,二、食品中金屬污染物的快速檢測(cè)—微波溶樣快速測(cè)定法,? 微波加熱是直接通過(guò)物質(zhì)吸收微波能量來(lái)達(dá)到快速加熱的目的，用密閉容器又能同時(shí)獲得高溫、高壓，這樣不僅能提高反應(yīng)的速率，而且還可以提高試樣的分解能力，以達(dá)到理想的消解效果。 在微波體系中，樣品分解要受到許多復(fù)雜因素的影響，其中樣品溶劑的選擇非常重要。大多數(shù)無(wú)機(jī)酸都是良好的微波吸收體，某些酸在密閉容器中經(jīng)微波作用后其穩(wěn)定性、蒸汽壓等性質(zhì)都會(huì)引起不同的變化 適合于原子吸收光譜分析中的樣品預(yù)處理。,131,,將密封微波溶樣技術(shù)與原子吸收光譜分析緊密地結(jié)合起來(lái)可以實(shí)現(xiàn)快速準(zhǔn)確測(cè)定金屬污染物。 密封微波溶樣技術(shù)作為一種樣品預(yù)處理手段，可以使這一過(guò)程更加快速、準(zhǔn)確、安全。,132,?樣品經(jīng)微波消解后，注入原子吸收分光光度計(jì)石墨爐中，電熱原子化后吸收283.3nm共振線，在一定濃度范圍，其吸收值與鉛含量成正比，與標(biāo)準(zhǔn)系列比較定量。,1.食品中鉛的快速檢驗(yàn)—微波消化-原子吸收分光光度法,133,2.食品中鎘的快速檢驗(yàn)—微波消化-原子吸收分光光度法 ? 樣品經(jīng)微波消解后，注人原子吸收分光光度計(jì)石墨爐中，電熱原子化后吸收228.8nm共振線，在一定濃度范圍，其吸收值與鎘含量成正比，與標(biāo)準(zhǔn)系列比較定量。,134,? 樣品經(jīng)微波消解后，在酸性介質(zhì)中，樣品溶液中的砷與硼氫化鉀或硼氫化鈉（NaBH4)反應(yīng)在氫化物發(fā)生系統(tǒng)中生成砷化氫，過(guò)量氫氣和砷化氫與載氣(氬氣)混合，進(jìn)人原子化器。氫氣和氫氣在特制點(diǎn)火裝置的作用下形成氬氫火焰，使待測(cè)元素原子化。砷空心陰極燈發(fā)射的特征譜線通過(guò)聚焦，激發(fā)氫氫焰中砷原子，基態(tài)原子被激發(fā)至高能態(tài)，在由高能態(tài)回到基態(tài)時(shí)，發(fā)射出特征波長(zhǎng)的原子熒光，其熒光強(qiáng)度與樣品中砷的濃度成正比，再與標(biāo)準(zhǔn)系列比較定量。,3.食品中砷的快速檢驗(yàn)—微波消化-原子 熒光分光光度法,135,樣品經(jīng)酸加熱消化后，在酸性介質(zhì)中，樣品溶液中的汞與硼氫化鉀或硼氫化鈉 (NaBH4)反應(yīng)，在氫化物發(fā)生系統(tǒng)中生成原子態(tài)汞蒸氣，過(guò)量氫氣和汞蒸氣與載氣 (氬氣)混合，進(jìn)入原子化器，氫氣和氫氣在特制點(diǎn)火裝置的作用下形成氬氫火焰，使待測(cè)元素原于化。汞空心陰極燈發(fā)射的特征譜線通過(guò)聚焦，激發(fā)氬氫火焰中汞原子，基態(tài)原子被激發(fā)至高能態(tài)，在由高能態(tài)回到基態(tài)時(shí)，發(fā)射出特征波長(zhǎng)的原子熒光，其熒光強(qiáng)度與樣品中汞的濃度成正比，再與標(biāo)準(zhǔn)系列比較定量。,4.食品中汞的快速檢臉—微波消化-原子熒 光分光光度法,136,1.簡(jiǎn)介:亞硝酸鹽主要是指亞硝酸鈉和亞硝酸鉀，是一種白色不透明結(jié)晶的化工產(chǎn)品，形狀極似食鹽，亞硝酸鹽是劇毒物質(zhì)，成人攝入0.2-0.5克即可引起中毒，3克即可致死。,,三、亞硝酸鹽快速測(cè)定（速測(cè)盒法）,137,亞硝酸鹽是一種致癌物質(zhì)；對(duì)胎兒有致畸作用；嬰兒“高鐵血紅蛋白癥”,2.亞硝酸鹽的危害性,138,,3.原理:將試劑作成藥片。亞硝酸鹽與藥片中的對(duì)氨基苯磺酰胺重氮化后，再與藥片中的鹽酸N-(1-萘基)乙二胺偶合，形成玫瑰紅色偶氮染料，顏色的深度與亞硝酸鹽的濃度成正比，與標(biāo)準(zhǔn)色卡比較定量。,139,取食鹽1平勺（約0.1g），加入到檢測(cè)管中，加純凈水至1mL刻度處，搖溶，10min后與標(biāo)準(zhǔn)色板對(duì)比，該色板上的數(shù)值乘上10即為食鹽中亞硝酸鹽的含量mg/kg。當(dāng)樣品出現(xiàn)血紅色且有沉淀產(chǎn)生或很快退色變成黃色時(shí)，可判定亞硝酸鹽含量相當(dāng)高，或樣品本身就是亞硝酸鹽。,140,液體樣品的檢測(cè)：取1mL液體樣品加入到檢測(cè)管中，操作方法與上相同，與標(biāo)準(zhǔn)色板對(duì)比，該色板上的數(shù)值即為樣品中亞硝酸鹽的mg/kg含量。液態(tài)奶屬于乳濁液，具有將近1倍的折色特性，所得結(jié)果乘以2即為樣品中亞硝酸鹽的近似含量mg/L。,141,固體或半固體樣品的檢測(cè)： 取均勻的樣品（如香腸）1.0g 至10mL比色管中，加純凈水至10mL，充分震搖后放置，取上清液或?yàn)V液 1mL加入到檢測(cè)管中(乳粉溶解后不用過(guò)濾，直接取乳濁液加入到檢測(cè)管中)，將試劑搖溶，10min 后與標(biāo)準(zhǔn)色板對(duì)比，找出顏色相同或相近的色階，該色階上的數(shù)值乘上10 即為樣品中亞硝酸鹽的mg/kg含量。如果測(cè)試結(jié)果超出色板上的最高值，可將樣品再稀釋10倍，測(cè)試結(jié)果乘上100即為樣品中亞硝酸鹽的含量。,142,注意事項(xiàng)(1)亞硝酸鹽含量較高時(shí)，試劑顯紅色后不久會(huì)變?yōu)辄S色，將黃色溶液再稀釋放入另一新的速測(cè)管中又會(huì)顯出紅色，由此區(qū)分是亞硝酸鹽還是食用鹽。(2)當(dāng)樣品反應(yīng)后的顏色大于標(biāo)準(zhǔn)色板2.00mg/L色階時(shí)，應(yīng)將樣品稀釋后再測(cè)，計(jì)算結(jié)果時(shí)乘上稀釋倍數(shù)。(3)生活飲用水中常有亞硝酸鹽存在，不宜作為測(cè)定用稀釋液。,案例：某加工點(diǎn) 在往鹵味食制品 中加入亞硝酸鈉,143,四、硝酸鹽試紙快速檢測(cè)方法,國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局發(fā)布的農(nóng)產(chǎn)品安全質(zhì)量8項(xiàng)系列標(biāo)淮2001年10月1日正式實(shí)施。其中，水果和蔬菜農(nóng)產(chǎn)品中硝酸鹽和亞硝酸鹽的限量，作為重要指標(biāo)列入。同時(shí)(亞)硝酸鹽的限量指標(biāo)在肉制品、魚(yú)(鮮)、肉類(lèi)(鮮)、蛋類(lèi)(鮮)、醬腌菜、乳粉、食鹽、肉類(lèi)罐頭、糧食(大米、面粉、玉米)等食品中和水質(zhì)分析中均有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)要求。 在蔬菜品質(zhì)方面硝酸鹽含量是衛(wèi)生(安全)品質(zhì)的一項(xiàng)重要指標(biāo)。,144,,檢測(cè)意義： 常見(jiàn)的硝酸鹽有硝酸鈉、硝酸鉀、硝酸銨和農(nóng)業(yè)氮素化肥轉(zhuǎn)化的硝酸鹽等。某些地區(qū)，由于常年施用氮素化肥，致使蔬菜瓜果以及牲畜飼料中硝酸鹽的含量較高。硝酸鹽本身的毒性并不大，但進(jìn)入人體后，會(huì)因腸道細(xì)菌的作用轉(zhuǎn)化生成一些亞硝酸鹽或胺類(lèi)物質(zhì)對(duì)人體構(gòu)成危害。,145,2.硝酸鹽含量的測(cè)定方法：(1)直接測(cè)定NO3-法;(2)硝酸鹽還原法 即還原為NO22-和NH4+，或 NO和還原物的測(cè)定;(3)非直接法 以N03-與化學(xué)物質(zhì)反應(yīng)形成一種化合物的濃度變化來(lái)測(cè)定N03-濃度。非直接法有原子吸收法(AAS)和極譜儀法。我國(guó)標(biāo)準(zhǔn)方法GB5009.33-1996和GB/T15401-1994使用的是硝酸鹽還原比色法，但操作煩瑣。,