食品中有毒有害物質(zhì)的快速檢測方法ppt課件

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1,第一節(jié) 農(nóng)藥殘留的快速檢測 第二節(jié) 獸藥殘留的快速檢測 第三節(jié) 真菌毒素及化學(xué)污染物的快速檢測 第四節(jié) 致病微生物的快速檢測 第五節(jié) 食品中異物的檢測方法,第二章 食品中有毒有害物質(zhì)的 快速檢測方法,2,一、何為快速檢測,快速檢測沒有經(jīng)典的定義，而是一種約定俗成的概念，即：包括樣品制備在內(nèi)，能夠在短時間內(nèi)出據(jù)檢測結(jié)果的行為稱之為快速檢測。,3,二、快速檢測的時間概念,理化快速檢驗方法：包括樣品制備在內(nèi)，能夠在兩小時以內(nèi)出具檢測結(jié)果，即可視為實驗室快速檢測方法。 如果方法能夠應(yīng)用于現(xiàn)場，在30分鐘內(nèi)出具檢測結(jié)果，即可視為現(xiàn)場快速檢測方法。如果能夠在10幾分鐘甚至幾分鐘內(nèi)得到檢測結(jié)果，可視其為比較理想的現(xiàn)場快速檢測方法。 微生物快速檢驗方法：與傳統(tǒng)檢驗方法相比，能夠縮短1/2或1/3的檢測時間，就可得到檢測結(jié)果, 可視為快速檢測方法。,4,第一節(jié) 農(nóng)藥殘留的快速檢測,農(nóng)藥是指用于消滅、控制危害農(nóng)作物的害蟲、病菌、鼠類、雜草、及其它有害動植物和調(diào)節(jié)植物生長的藥物。,5,按用途分九種： 殺蟲劑、殺螨劑、殺線蟲劑、殺軟體動物劑、殺鼠劑、殺菌劑、除草劑、脫葉劑、植物生長調(diào)節(jié)劑。 農(nóng)藥殘留：農(nóng)藥使用后殘存于生物體、農(nóng)副產(chǎn)品和環(huán)境中的微量農(nóng)藥原體、毒代謝物、降解物和雜質(zhì)的總稱，殘存的數(shù)量稱殘留量，一般以每千克中有多少毫克表示。 農(nóng)藥殘留量是施藥后的必然現(xiàn)象，但如果超過最大殘留量，對人畜產(chǎn)生不良影響或通過食物鏈對生態(tài)系統(tǒng)中的生物造成毒害，則稱為農(nóng)藥殘留毒性（簡稱殘毒）。,6,目前，我國農(nóng)藥殘留較為突出的是蔬菜中的農(nóng)藥殘留問題。近年來蔬菜被農(nóng)藥污染的情況有增無減，有機(jī)磷農(nóng)藥殘留尤為突出。,有機(jī)磷農(nóng)藥多為磷酸酯類或硫代磷酸酯： 對硫磷（1605）、內(nèi)吸磷（1059）、馬拉硫磷（4049）、樂果、敵百蟲、敵敵畏。,7,控制蔬菜中農(nóng)藥殘留對人體的危害，最為有效的方法之一是加強(qiáng)對蔬菜中的農(nóng)藥殘留檢測的力度。 傳統(tǒng)的農(nóng)藥分析主要依賴于氣相或液相色譜等儀器，儀器分析雖然可以檢出樣品中較微量的農(nóng)藥，但操作復(fù)雜、費時費工、檢測成本較高。,8,農(nóng)藥殘留快速測定方法從反應(yīng)原理上分為生物法和化學(xué)法。生物法: 活體生物測定法:使用發(fā)光細(xì)菌或敏感性家蠅作為測定材料。 分子生物學(xué)方法:采用免疫反應(yīng)如酶聯(lián)免疫反應(yīng)。 生物化學(xué)測定法:利用膽堿酯酶抑制原理。,9,農(nóng)藥殘留快速測定法從儀器使用上分為： 氣相色譜儀法 液相色譜儀法 農(nóng)藥殘留分光光度法(抑制率法) 目視法(如有機(jī)磷農(nóng)藥速測靈法、農(nóng)藥殘 留試紙法、酶片法)。,10,一、免疫分析技術(shù),? 常用于農(nóng)藥殘留分析的免疫分析技術(shù)有：,酶免疫技術(shù),放射免疫技術(shù),RIA,EIA,11,1.放射免疫技術(shù),放射免疫技術(shù)是以放射性同位素為標(biāo)記物的標(biāo)記免疫分析法,用于定量測定受檢標(biāo)本中的抗原或抗體。 基本原理是：采用定量的標(biāo)記抗原（Ag*）和非標(biāo)記抗原（Ag）對有限量特異性抗體(Ab)的競爭結(jié)合反應(yīng)。,12,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,結(jié)合型的標(biāo)記抗原Ag*-Ab(B),游離型標(biāo)記抗原Ag*(F),放射免疫分析法的原理與方法,13,,先將放射性同位素標(biāo)記已知抗原或抗體，與待檢標(biāo)本反應(yīng)后，用γ射線探測儀或閃爍計算器測定γ射線或β射線的放射性強(qiáng)度，根據(jù)放射性強(qiáng)度計算標(biāo)本中抗原或抗體的含量。 它將放射性核素顯示的高靈敏性和抗原抗體反應(yīng)的特異性結(jié)合，使檢測的敏感性達(dá)10pg水平。 常用于標(biāo)記的同位素有8H、125I和3H 。,14,測定方法與步驟,(1)抗原抗體反應(yīng)：平衡法。 (2)分離結(jié)合與游離標(biāo)記物 沉淀劑沉淀復(fù)合物，離心分離。 (3)放射性測定及數(shù)據(jù)處理 晶體閃爍計數(shù)儀(γ射線)或液體閃爍計數(shù)儀( β射線)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算待檢抗原濃度。,15,β液閃儀,16,γ計數(shù)器,但是由于放射免疫分析法需要較昂貴的液體閃爍儀或放射儀，且放射性同位素對工作人員有一定的傷害，廢棄物又不易處理，這些不利因素限制了該法的廣泛應(yīng)用。,17,2.酶免疫技術(shù)(EIA ),酶免疫技術(shù)是用酶標(biāo)記的已知抗原或抗體，檢測標(biāo)本中的相應(yīng)抗體或抗原，將抗原抗體反應(yīng)的特異性與酶催化反應(yīng)的專一性相結(jié)合的免疫檢測技術(shù)。,18,酶聯(lián)免疫吸附法 （enzyme linked immunosorbant assay， ELISA）,酶聯(lián)免疫吸附法是把抗原抗體反應(yīng)的特異性和酶的高效催化作用有機(jī)結(jié)合起來的一種免疫檢測技術(shù)。 將已知抗原或抗體吸附在固相載體(聚苯乙烯板)上進(jìn)行酶免疫反應(yīng)，檢測相應(yīng)的抗體或抗原。 應(yīng)用：食品中毒素的測定、食品有害微生物的快速檢測、食品中農(nóng)藥殘留的檢測、食品中抗生素殘留的檢測 （如氯霉素）,19,ELISA基本原理,使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。 使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。 把受檢標(biāo)本（測定其中的抗體或抗原）和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。,20,用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開，最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。 加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺進(jìn)行定性或定量分析。,21,ELISA原理圖,,,22,ELISA基本的實驗過程,23,ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體,在這種測定方法中有3種必要的試劑：,①固相的抗原或抗體,②酶標(biāo)記的抗原或抗體,③酶作用的底物,24,ELISA的一般操作方法,固相載體的準(zhǔn)備：最常用的是聚苯乙烯微量反應(yīng)板，規(guī)格有40孔、72孔、96孔，板孔呈凹型，應(yīng)用方便。 抗原或抗體的包被：將Ag或Ab吸附到固相載體的過程稱為包被。 固相載體的封閉：固相載體包被Ag(或Ab)后，載體表面可能因殘留未吸附蛋白質(zhì)的活性部位而吸附抗體或酶標(biāo)抗體，引起試驗誤差；因此需事先用含0.5％BSA-0.05％吐溫-20的PBS封閉30～60分鐘（37℃），以降低非特異性吸附。,25,固相載體的洗滌：洗滌是在整個酶聯(lián)免疫吸附測定的操作過程中不可缺少的一個步驟，每加一層反應(yīng)結(jié)束后均要洗滌固相載體板，目的在于防止重疊反應(yīng)引起的非特異性吸附。---常用的洗滌液為：0.02M，pH7.2(或7.4)的PBS(含NaCl 0.15M，0.05％吐溫-20)；洗滌時先將加入的反應(yīng)液倒干，然后加洗滌液于孔中，泡洗3分鐘，重復(fù)3次，最后傾去洗滌液，用吸水紙吸干。,26,雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的方法。 方法：先將已知抗體吸附在固相載體上，加入待檢抗原，再加入酶標(biāo)記的已知抗體，反應(yīng)后形成“抗體-抗原-酶標(biāo)抗體”復(fù)合物，最后加入酶的底物顯色。應(yīng)用：常用于檢驗各種蛋白質(zhì)等大分子抗原。適用于分子中具有至少兩個抗原決定簇的多價抗原，而不能用于小分子半抗原的檢測。,雙抗體夾心法,27,,28,,,,1、已知抗體包被于載體表面,3、加酶標(biāo)抗體與抗原結(jié)合,4、加酶作用的底物 產(chǎn)生顏色,2、加待檢物 抗原與抗體結(jié)合,4、加酶作用的底物不產(chǎn)生顏色,,,,雙抗體夾心法測抗原,,1、已知抗體包被于載體表面,2、加待檢物無抗原與抗體結(jié)合,3、加酶標(biāo)抗體無抗原結(jié)合,+,-,Y,,Y,E,Y,,Y,Y,Y,Y,Y,,,,,Y,Y,,Y,Y,,,,Y,Y,Y,Y,Y,Y,29,原理為標(biāo)本中的抗原(抗體)和一定量的酶標(biāo)抗原(抗體)競爭與固相抗體(抗原)結(jié)合。 方法：用已知抗體(抗原)包被，加入待測血清，再加酶標(biāo)抗原(抗體)，酶標(biāo)抗原(抗體)與待檢物競爭與包被物結(jié)合。加底物顯色。 應(yīng)用：可用于測定抗原和半抗原，也可用于測定抗體。,競爭法,30,,,,,,,,競爭法測抗原,+,-,,Y,,Y,Y,Y,Y,Y,,Y,Y,E,Y,,,,2、加待檢物 抗原與酶標(biāo)抗 原競爭與抗體 結(jié)合,3、加酶作用 的底物不顯色 或顯色弱,3、加酶作用 的底物顯色,1、已知抗體包 被于載體表面,1、已知抗體包 被于載體表面,2、加待測物 和酶標(biāo)抗原， 酶標(biāo)抗原與抗 體結(jié)合,31,,原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體以檢測已與固相結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法。方法：先將已知抗原吸附在固相載體上，加入待檢血清，再加入酶標(biāo)記的抗抗體，反應(yīng)后形成“抗原-抗體-酶標(biāo)抗抗體”復(fù)合物，最后加入酶的底物顯色。優(yōu)點：一種酶標(biāo)抗抗體檢測各種與抗原相應(yīng)的抗體應(yīng)用：主要用于對病原體抗體的檢測而進(jìn)行傳染病的診斷。,間接法,32,33,34,底物顯色 ：必須用反應(yīng)后能形成水溶溶性色素的供氫體，常用的有鄰苯二胺 (CPD)，聯(lián)苯茴香胺，5-氨基水楊酸和鄰聯(lián)甲苯胺 。于用前配制避光保存，加入反應(yīng)孔作用20～30min。 顯色終止：陰性對照孔微微出現(xiàn)顏色，加入終止液（2M H2SO4）,35,結(jié)果判定：在白色背景上，用肉眼觀察，每批試驗均需有陰性對照。顏色反應(yīng)明顯深于對照組者判為陽性。 酶標(biāo)儀測定，待檢孔OD值 (P)與對照孔OD值(N)的比值(P/N)大于1.5或2.0者為陽性。 定量測定：對于抗原的定量測定（如酶標(biāo)記抗原競爭法），需事先用標(biāo)準(zhǔn)抗原制備一條吸收值與濃度的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)曲線，只要測出樣品的吸收值，即可查出其抗原濃度。,36,優(yōu)點: ①可以通過顏色來快速做定性結(jié)果分析; ②特異性強(qiáng); ③靈敏度高; ④酶標(biāo)板上一次可作多份樣品檢測。,37,標(biāo)記酶要求很高，應(yīng)具備:①純度高、溶解性高、特異性強(qiáng)、 穩(wěn)定性高;②測定方法應(yīng)簡單、敏感、快速;③與底物作用后會呈現(xiàn)顏色;④與抗體交聯(lián)后，仍保持酶的活性。,38,最常用的是辣根過氧化物酶(HRP)，它廣泛存在于植物界，辣根中的含量尤高。HRP是一種糖蛋白，由酶蛋白和鐵啉結(jié)合而成，相對分子質(zhì)量為40000，其底物是二氨基聯(lián)苯胺(DAB)，DAB經(jīng)酶解可產(chǎn)生棕褐色沉淀物。因而可用目測或用比色法測定。 還有堿性磷酸酶、酸性磷酸酶、蘋果酸脫氫酶、葡萄糖氧化酶和β-D-半乳糖苷酶等可供應(yīng)用。,39,3.RIA和EIA技術(shù)異同點,相同點：1)RIA與EIA技術(shù)的原理基本一致，即抗原與抗體反應(yīng)，形成抗原一抗體復(fù)合物。2)RIA與EIA檢測技術(shù)都是由反應(yīng)系統(tǒng)和檢測系統(tǒng)組成， 不同點：1)RIA技術(shù)以放射性同位素作指示劑(標(biāo)記物)；而在EIA技術(shù)中，用作標(biāo)記物的指示劑為生物酶。,40,2)RIA技術(shù)操作過程中檢測放射性同位素需要昂貴的儀器設(shè)備和防輻射設(shè)備，并且需要專業(yè)人員。相對于RIA技術(shù)而言，EIA技術(shù)有更多的優(yōu)點，如靈敏度高、特異性強(qiáng)、成本低、簡便快速、自動化程度高、檢測方法多樣和安全等。 因此，EIA技術(shù)，尤其是酶聯(lián)免疫吸附分析技術(shù)(ELISA)，已成為目前使用最普及的免疫分析技術(shù)。,41,目前，國外已研制出幾十種農(nóng)藥的酶免疫檢測試劑盒，包括有機(jī)磷類、氦基甲酸酯類、硫代氨基甲酸酯類、有機(jī)氯類、擬除蟲菊酯類及酰胺類等。 美國使用的ELISA試劑盒對有機(jī)磷農(nóng)藥普遍的最小檢出濃度達(dá)20pg/kg，對氨基甲酸酯類農(nóng)藥普遍的最小檢出濃度達(dá)300ug/kg。 免疫檢測試劑盒使用起來簡便、快速，操作人員不需經(jīng)過特殊培訓(xùn)，樣品不需凈化或只需簡單的凈化。,42,二、生物化學(xué)測定法,生物化學(xué)測定法包括農(nóng)藥速測卡法、農(nóng)藥速測片法、農(nóng)藥殘留分光光度計法。 運用膽堿酯酶抑制法檢測有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的一種快速現(xiàn)場檢測方法。,農(nóng)藥殘留速測儀,43,1.農(nóng)藥速測卡法農(nóng)藥速測卡法又稱農(nóng)藥殘留試紙法、酶試紙法。 原理：膽堿酯酶可催化靛酚乙酸酯(紅色)水解為乙酸靛酚(藍(lán)色)，有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥對膽堿酯酶有抑制作用，使催化、水解、變色的過程發(fā)生改變，由此可判斷出樣品中是否含有有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥的存在。,,44,蔬菜表面測定法（粗篩法）：擦去蔬菜表面泥土，滴2～3滴浸提液在蔬菜表面，用另一片蔬菜在滴液處輕輕摩擦。取一片速測卡，將蔬菜上的液滴滴在白色藥片上。放置10min進(jìn)行預(yù)反應(yīng)，將速測卡對折后，用手捏3min時，打開與空白對照實驗卡比較判定。,分析步驟：,45,蔬菜整體測定法：選取有代表性的蔬菜樣品，擦去表面泥土，剪成1cm左右見方碎片，取5g放入帶蓋瓶中，加入10mL浸提液，震搖50次，靜置2min以上。取2～3滴浸提液滴在速測卡上，以下操作與表面測定法相同。 飲用水中污染農(nóng)藥的檢測：直接取2～3滴加到速測卡上進(jìn)行操作。,46,中毒殘留物中農(nóng)藥的檢測：取樣品適量于容器中，加入2倍量的乙酸乙酯，充分震搖后靜置，取澄清液于蒸發(fā)皿中，在水浴上蒸干乙酸乙酯，取1mL磷酸鹽浸提液溶解蒸干后的殘渣，取殘渣溶液2～3滴于速測卡白色藥片上進(jìn)行檢測。,47,結(jié)果判定：,48,速測卡法測定結(jié)果,與空白對照卡比較,49,2.農(nóng)藥殘留分光光度計法又稱抑制率法。利用膽堿酯酶原理。在一定條件下，有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥對膽堿酯酶有抑制作用，其抑制率與農(nóng)藥的濃度呈正相關(guān)系。如果樣本提取液中含有有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥，酶的活性就被抑制，試驗中加入的基質(zhì)就不能被酶水解，從而不顯色或顏色變化很小;如果樣本提取液中不含有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥，酶的活性就不被抑制，試驗中加入的基質(zhì)就被酶水解或少部分水解，水解產(chǎn)物與加入的顯色劑反應(yīng)產(chǎn)生顏色，用分光光度計測定吸光值隨時間的變化，計算機(jī)出抑制率，就可以判斷出蔬菜中含有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥的殘留情況。,50,,51,操作步驟：,① 樣品處理：選取有代表性的蔬菜樣品，檫去表面泥土，剪成1cm左右見方碎片，取1g放入燒杯或提取瓶中，加入5mL緩沖溶液浸沒菜葉，每3min搖動一下燒杯，于10min后吸取2.5mL提取液于試管，待測。,52,② 測定： 對照溶液測試：于試管中加入2.5mL緩沖溶液，再加入0.1mL酶液、0.1mL底物搖勻，此時檢液開始顯色反應(yīng)，應(yīng)立即放入儀器比色池中，于410nm波長下比色，記錄反應(yīng)3min的吸光度變化值或儀器記錄值A(chǔ)0。 樣品測試：于試管中加入2.5mL樣品提取液，其它操作與對照溶液測試相同，記錄反應(yīng)3 min的吸光度變化值或儀器記錄值A(chǔ)t。 ③ 結(jié)果的表述計算： 注意：使用速測儀可以直接讀出抑制率值，而無須手工計算。,53,,結(jié)果判定,如現(xiàn)有方法在使用乙酰膽堿酯酶時，抑制率為50%;使用丁酰膽堿酯酶時，抑制率定為70%。,54,優(yōu)點：具有快速、靈敏、經(jīng)濟(jì)的特點，樣本無需凈化，縮短了檢測時間。 缺點：1)不能定性定量，只能作為對含有機(jī)磷農(nóng)藥和氨基甲酸酯農(nóng)藥殘毒的蔬菜進(jìn)行初篩的一種方法，將一部分含農(nóng)藥殘毒的蔬菜控制在市場之外。2) 不適宜檢測一些含辛辣物質(zhì)的蔬菜如蘿卜、韭菜以及一些如菱白、蘑菇等鹵類蔬菜(含有破壞酶活性的物質(zhì))。3)對殘留量愈大的蔬菜，測定的誤差愈小。,55,假陽性是由于酶活性降低或失活，底物不與之反應(yīng)，從而不能被水解，無法與顯色劑結(jié)合顯色。 假陰性是因為某些農(nóng)藥對酶抑制作用很小或無作用而產(chǎn)生的，表現(xiàn)出無農(nóng)藥殘留的假象。 另外，在反應(yīng)過程中化學(xué)、物理干擾都有可能導(dǎo)致假陽性、假陰性的發(fā)生。 靈敏度、重復(fù)性和回收率相對較差。 新方法：酶抑制-生物芯片分析法。,56,?由于此方法不能定性定量，所以當(dāng)測出有殘毒的蔬菜時，如果要作為仲裁處理，還應(yīng)該送往有關(guān)部門進(jìn)一步用氣相色譜等實驗室儀器進(jìn)行定性和定量分析，其結(jié)果方可作為最終結(jié)論性數(shù)據(jù)。 2001年，農(nóng)藥速測卡法和農(nóng)藥殘留分光光度計法(抑制率法)被制定為國家標(biāo)準(zhǔn)推薦分析方法，即《蔬菜中有機(jī)磷和氨基甲酸酯農(nóng)藥殘留量快速檢測方法》(GB/ T5009.199)，2002年公布實施。,57,,,58,三、化學(xué)方法1.農(nóng)藥多殘留掃描法(MRSM) 傳統(tǒng)的農(nóng)藥殘留分析，即樣本經(jīng)過提取、凈化后用氣相色譜、液相色譜等分析儀器進(jìn)行定性定量分析測定。傳統(tǒng)的化學(xué)分析儀器法花費的時間長。 農(nóng)藥多殘留方法是在一次分析中同時測定一種以上農(nóng)藥殘留的方法。,59,我國MRSM技術(shù)是1999年開始推廣的一種對農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥多殘留快速掃描技術(shù)，簡化了傳統(tǒng)檢測技術(shù)的前處理，采用固相萃取，并使用氮吹儀代替常用的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器進(jìn)行濃縮，大大縮短了分析時間。 該法與上面介紹的快速測定方法的區(qū)別:(1)使用大型的儀器設(shè)備，如氣相色譜議和液相色譜儀，脫離不了實驗室;(2)可以進(jìn)行農(nóng)藥殘留定性和定量分析;(3)可以進(jìn)行未知農(nóng)藥殘留的測定;(4)可檢測各類蔬菜或水果樣本中四大類(有機(jī)氯、有機(jī)磷、氨基甲酸酯、除蟲菊酯類)的農(nóng)藥殘留;(5)對各類農(nóng)藥靈敏度均較高。作為仲裁依據(jù)；一種實驗室快速檢測技術(shù)。,60,氮吹儀,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器,利用氮氣流將溶劑帶出樣品，一般在加熱條件下進(jìn)行。,用于少量液體的濃縮，蒸汽壓較高的組分易損失。 不能用于酸、堿物質(zhì)的濃縮,61,,62,2.有機(jī)磷農(nóng)藥速測靈法(金屬離子催化顯色表面皿法) 原理是具有強(qiáng)催化作用的金屬離子催化劑、使各類有機(jī)磷農(nóng)藥 (磷酸酯、二硫代酸酯、磷酰胺)在催化作用下水解為磷酸與醇，水解產(chǎn)物與顯色劑反應(yīng)，使顯色劑的紫紅色褪去變成無色。,63,,這種方法操作簡便、價格便宜、檢測速度快，采用化學(xué)反應(yīng)原理，避免了通常所使用生化方法（酶法）的缺點（酶的制備、保存以及反應(yīng)需比較嚴(yán)格的條件），靈敏度也達(dá)到一定的要求。但主要針對的是有機(jī)磷農(nóng)藥的殘留檢測，特別是甲胺磷、對硫磷農(nóng)藥的定性檢測。 操作簡便、價廉、檢測速度快，但是容易受到植物組織液、葉綠體干擾，故只能用于檢測葉片、果品表面的農(nóng)藥殘留。,64,第二節(jié) 獸藥殘留的快速檢測,一、傳統(tǒng)微生物抑制試驗(MIT) ?獸藥殘留（residues of veterinary drugs）指動物用藥后，任何可食動物源性產(chǎn)品中所含有的原型藥物或/和其代謝產(chǎn)物，以及與獸藥有關(guān)雜質(zhì)的殘留。,65,,最大殘留限量（maximum residue limit, MRL）：食品動物用藥后，允許存在食物表面或內(nèi)部的該獸藥殘留的最高量/濃度（以鮮重計，表示為mg/kg或μg/kg）,66,,分析大量樣品中抗生素的殘留物通常采用MIT法。這些方法是建立在活性藥物抑制微生物生長能力的基礎(chǔ)上。 通用的抑制試驗是圓盤檢驗技術(shù)。將樣品提取液點在接種有試驗菌的瓊脂上，培養(yǎng)后可測定抗菌藥物形成的抑菌圈。抑菌圈表明抗生素的存在，而圈的大小則與抗生素的濃度有關(guān)。,67,嗜熱脂肪芽孢桿菌紙片法。國際上公認(rèn)并作為法定檢測食品中抗生素殘留的方法首推嗜熱脂肪芽孢桿菌紙片法。 利用抗生素培養(yǎng)基接種嗜熱脂肪芽胞桿菌芽胞，把接種培養(yǎng)基6ml倒入各個15mm×100mm的培養(yǎng)皿中(平皿需于7天內(nèi)使用)，紙片直徑12.7mm浸漬奶樣，放于瓊脂中，把平皿于64℃培養(yǎng)2小時或55℃培養(yǎng)4 小時，培養(yǎng)結(jié)束，用毫米游標(biāo)尺測量抑菌圈直徑，陽性結(jié)果以≥16mm為準(zhǔn)。 本法可進(jìn)行定量測定，1981年由FDA認(rèn)可，1982年1月1日起生效為法定方法。,68,,69,此法有6項優(yōu)點: ①用嗜熱脂肪芽孢桿菌芽孢懸浮物代替藤黃八迭球菌過夜肉湯培養(yǎng)物做試驗菌，故性質(zhì)更穩(wěn)定，貯存時間更長，可達(dá)5-8個月; ②檢測敏感度高，能檢出牛奶中青霉素G含量為0.005U/mL; ③方法簡便、快速、省錢，2-4h可出現(xiàn)抑菌圈; ④不僅能檢測青霉素G，還能檢測其他多種常用抗生素如氨芐青霉素、氯青霉素和四環(huán)素等。 ⑤可作定量測定; ⑥不受消毒劑干擾。,70,TTC 法是目前我國食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的檢測牛奶中抗生素殘留的檢測方法。 原理：細(xì)菌生物氧化有方式，即加氧、脫氧和脫電子，相反即還原。當(dāng)乳中加入嗜熱鏈球菌后，如乳中無抗生素，嗜熱鏈球菌就生長繁殖，在新陳代謝過程中進(jìn)行生物氧化，其中脫出的氫可以和加在乳中的氧化型TTC結(jié)合而成為還原型TTC，氧化型TTC是無色的，還原型TTC是紅色，所以可使乳變紅色為陰性。相反，如乳中存在抗生素，嗜熱鏈球菌就不能生長繁殖，沒有氫釋放，TTC也不能被還原仍為無色，被檢樣保持鮮乳的顏色，即為陽性。,二、氯化三苯四氮唑法(TTC),71,TTC 法能檢出牛奶中青霉素含為0.004U/mL。 日本20世紀(jì)50年代TTC法是檢測牛奶中青霉素殘留的法定方法。 該方法1955年4月1日起在我國生效為法定方法。,72,三、酶聯(lián)免疫吸附劑測定(ELlSA),? ELlSA測定法是根據(jù)酶標(biāo)記的抗體或抗抗體來進(jìn)行的抗原—抗體反應(yīng)。 由于酶的專一性催化作用，可使原來無色的底物通過水解，氧化或還原反應(yīng)而顯示顏色。,73,市面上有關(guān)歐美針對抗生素殘留檢測的商品化ELISA試劑盒有許多。 英國Randox公司ELISA試劑盒已獲AOAC認(rèn)可。 2001年12月21日國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局推薦英國Randox公司的ELISA試劑盒作為動物激素、抗生素殘留的首選篩選試劑。,74,四、放射免疫測定法,RIA測定就是應(yīng)用放射性物質(zhì)代替ELISA中的標(biāo)記酶作為抗體的偶聯(lián)物，在食品安全快速檢測中最常見的同位素是6H和14C。 1978年charm氏在RIA技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展了放射免疫受體檢測技術(shù)(RRA)。,75,RRA在檢測食品中抗生素殘留的原理： (1)每類抗生素族均是在一個母環(huán)基礎(chǔ)上用不同功能團(tuán)修飾形成特定功效的抗生素。 (2)微生物細(xì)胞表面都存在著能與各種抗生素功能基團(tuán)結(jié)合的特異受點(這種高度的專一性類似于抗原和抗體間的專一性)。,76,,抗生素抑制細(xì)菌生長的能力是由微生物特定位上的附著決定的，并由此打斷該細(xì)菌的代謝活動。 結(jié)合反應(yīng)是在標(biāo)記的靶參考物(示蹤物)與無標(biāo)記的待測藥物(非標(biāo)記物)之間競爭進(jìn)行的。測試建立在藥物的功能團(tuán)和微生物細(xì)胞專一性受點的結(jié)合反應(yīng)的基礎(chǔ)上。,77,此方法將細(xì)胞上具有特異性受體點的細(xì)菌加到含有6H或14C標(biāo)記藥物的牛奶或組織提取物中，這些加放射標(biāo)記的藥物與樣品中所含的藥物殘留物競爭可利用的細(xì)胞受體部位，樣品經(jīng)離心除去上清液，沉淀在β-閃爍液重新懸浮，用液體閃爍計數(shù)器來測量其放射性。 牛奶、血清、雞蛋、組織中的檢測限在低于10-6范圍內(nèi)。,78,在現(xiàn)有的放射性檢疫檢測方法中，作為快速檢測方面最成功的例子，是CharmⅡ6600/7600抗生素快速檢測系統(tǒng)。 該檢測系統(tǒng)可以檢測動物和魚類的肌肉組織、蛋類、飼料、蜂蜜、水、水果、蔬菜、谷物等樣品。 目前CharmⅡ7600檢測系統(tǒng)就β-內(nèi)酰胺、 氯霉素類、氨基糖苷類、四環(huán)素類、磺胺類、鄰氯青霉素及堿性磷酸酶這六項檢測已被FDA認(rèn)可。,79,五、磺胺二甲基嘧啶快速測定,??磺胺藥物廣泛的用作為飼料添加劑，因此殘留可能發(fā)生在動物源性食品中，例如牛奶和肉類中。特別是致癌性的磺胺二甲基嘧啶給人類的健康帶來了威脅。 對于磺胺二甲基嘧啶殘留的檢測，由于微生物抑制分析方法缺乏靈敏度和特異性。 高相液相色譜是最常采用的方法。然而HPLC方法的缺點是制備樣品要耗費大量時間、并且需要昂貴的實驗室設(shè)備。 酶標(biāo)免疫分析定量測定磺胺二甲基嘧啶殘留方法適于日常大量樣品的篩選，特別是近年發(fā)展的試劑盒為快速篩選提供了途徑。。,80,酶標(biāo)免疫分析定量測定磺胺二甲基嘧啶殘留方法適于日常大量樣品的篩選，特別是近年發(fā)展的試劑盒為快速篩選提供了途徑。 競爭酶標(biāo)免疫法可以定性和定量測定牛奶、肉類及腎臟中的磺胺二甲基嘧啶殘留。,81,操作步驟：,微孔板包被有針對兔IgG(磺胺二甲基嘧啶抗體)的羊抗體。加入磺胺二甲基嘧啶抗體，磺胺二甲基嘧啶酶標(biāo)記物，標(biāo)準(zhǔn)或樣品溶液。游離磺胺二甲基嘧啶與磺胺二甲基嘧啶密酶標(biāo)記物競爭磺胺二甲基嘧啶抗體，同時磺胺二甲基嘧啶抗體與羊抗體連接。沒有連接的酶標(biāo)記物在洗滌步驟中被除去。將酶基質(zhì)(過氧化尿素)和發(fā)色劑(四甲基聯(lián)苯胺)加入到孔中并且孵育。結(jié)合的酶標(biāo)記物將無色的發(fā)色劑轉(zhuǎn)化為收色的產(chǎn)物。加入反應(yīng)停止液后使顏色為藍(lán)轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色。在450nm處測量，吸收光強(qiáng)度與樣品中的磺胺二甲基嘧啶濃度成反比。,82,RIDASCREEN磺胺二甲基嘧啶試劑盒的平均檢測下限約為1μg/kg。根據(jù)樣品處理記錄，在牛奶中磺胺二甲基嘧啶的檢測下限為10μg/kg（10ppb）,在肉類及腎臟中磺胺二甲基嘧啶的檢測下限為2μg/kg( 2ppb)， 蜂蜜中磺胺二甲基嘧啶的檢測下限為1μg/kg(1ppb)。,磺胺總量試劑盒是競爭性酶聯(lián)免疫法，定量檢測蛋、肉（雞肉和豬肉）、魚、蝦、蜂蜜和奶類樣品中的磺胺類藥物總量。,83,快速、高通量獸藥殘留檢測系統(tǒng),生物芯片法 英國Randox公司evidence investigator系統(tǒng)：是以生物芯片技術(shù)為核心，集合免疫學(xué)原理和高靈敏的化學(xué)發(fā)光技術(shù)，通過對單個微量樣品進(jìn)行多種檢測項目組合的定量檢測，提供高通量、高精度的實驗結(jié)果?？焖俪鰣蟾妫哼@是目前世界上最快的分析系統(tǒng)，可在2小時內(nèi)完成對540個樣品的分析，每個樣品的檢測項目達(dá)6-12種； 真正實現(xiàn)多通道檢測：一次可檢測54個樣品，每個樣品可同時檢測6-12種成分；,84,六、鹽酸克倫特羅快速測定,1.簡介 瘦肉精學(xué)名為鹽酸克倫特羅。鹽酸克倫特羅為克倫特羅的鹽酸鹽形式，用于藥名又稱克喘素。 它屬于β-腎上腺素類激動劑類，是一種交感神經(jīng)末梢的介質(zhì)。可增強(qiáng)代謝、加快心跳和增強(qiáng)血管收縮和擴(kuò)張氣管，臨床上用于治療哮喘。,瘦肉精,85,上世紀(jì)80年代初，美國脂胺公司研究人員意外地發(fā)現(xiàn)，將一定量的鹽酸克倫特羅加入飼料中，能夠改變營養(yǎng)物質(zhì)的代謝途徑，促進(jìn)動物肌肉特別是骨胳肌蛋白質(zhì)的合成，同時抑制脂肪合成，從而促進(jìn)動物生長，增加瘦肉率。根據(jù)試驗得出，在飼料中添加適量的鹽酸克倫特羅，可以提高飼料轉(zhuǎn)化率、生長速率、瘦肉相對增加10％以上，于是這項技術(shù)開始在養(yǎng)殖業(yè)中大行其道。,瘦肉精用于養(yǎng)殖的發(fā)現(xiàn),,86,作用機(jī)理,,它的主要作用機(jī)理是作為一種強(qiáng)效激動劑，選擇性的作用于腎上腺素β2受體上，激活腺苷酸環(huán)化酶(cAMP)，使環(huán)磷腺苷增加，加強(qiáng)脂肪分解，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，實現(xiàn)動物營養(yǎng)再分配，故又將瘦肉精稱作“生長促進(jìn)劑(growth promoter)”和營養(yǎng)“重分配劑(repartitioning agent)”。,87,2.痩肉精危害,,,可增強(qiáng)脂肪代謝，減慢蛋白質(zhì)分解代謝，可顯著提高飼料轉(zhuǎn)化率和瘦肉率。 瘦肉精性狀穩(wěn)定，加熱到172℃以上分解，一般的家庭烹飪很難去毒。 中毒臨床表現(xiàn)有：心跳過速、心慌、精神緊張、肌肉震顫、肌肉疼痛、頭疼、暈眩等。若長期食用，有可能導(dǎo)致染色體畸變，誘發(fā)惡性腫瘤。 有心臟病、高血壓、甲亢等患者可能食用后會有生命危險。,88,2001年8月22日，廣東信宜市510人因食用殘留鹽酸克倫特羅的豬肉而中毒，其中51人出現(xiàn)嚴(yán)重的中毒現(xiàn)象。 11月7日廣東省河源市484人，也都因食用含有鹽酸克倫特羅的豬肉或豬肝而中毒。,動物性食品中毒案例,,89,但當(dāng)前瘦肉精卻屢禁不止，原因之一就是國內(nèi)外檢測CLB的方法手段還不夠完善，還沒有建立宰前監(jiān)測體系和準(zhǔn)確迅速方便精確的檢測方法，從而使不法分子有機(jī)可乘。,當(dāng)前現(xiàn)狀,,90,鹽酸克倫特羅一般使用HPLC或GC-MS進(jìn)行測定，但是其前處理步驟繁瑣且費用昂貴。 鹽酸克倫特羅測定試劑盒則是一種有用的篩選方法，可用在檢測尿、肌肉、肝臟等的鹽酸克倫特羅殘留。 RIDASCREEN Clenbuterol Fast(克倫特羅測定試劑盒)是非常有用的篩選方法。競爭酶標(biāo)免疫法定量測定尿、肌肉、肝臟及牛眼中的克倫特羅（Clenbuterol）。,91,測定原理,測定的基礎(chǔ)是抗原抗體反應(yīng)。微孔板包被有針對兔IgG（克倫特羅抗體）的羊抗體?？藗愄亓_抗體被加入，經(jīng)過孵育及洗滌步驟后，加入克倫特羅酶標(biāo)記物，標(biāo)準(zhǔn)或樣品溶液。克倫特羅與克倫特羅酶標(biāo)記物競爭克倫特羅抗體，沒有連接的克倫特羅酶標(biāo)記物在洗滌步驟中被除去。將酶基質(zhì)（過氧化尿素）和發(fā)色劑（四甲基聯(lián)苯胺）加入到孔中并且孵育。結(jié)合的酶標(biāo)記物將無色的發(fā)色劑轉(zhuǎn)化為藍(lán)色的產(chǎn)物。加入反應(yīng)停止液后使顏色由藍(lán)轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色。在450nm處測量，吸收光強(qiáng)度與樣品中的克倫特羅濃度成反比。,,,92,,,一般含鹽酸克倫特羅的豬肉色特別鮮紅，脂肪非常薄，肉皮緊貼著瘦肉，瘦肉纖維比較疏松，肉皮與瘦肉之間幾乎無肥肉( 肥膘厚度不到1.5cm) 一般健康肉淡紅色肉質(zhì)彈性好通過這種感官識別方法就可以快速簡單定性對動物性食品中有無CLB作出初步判定。缺點：只是一種經(jīng)驗的判斷，不夠準(zhǔn)確,感官識別,,93,第三節(jié) 真菌毒素及化學(xué)污染物的 快速檢測,一、食品中真菌毒素的快速測定 真菌及真菌毒素污染食品后，引起的危害： 真菌引起食品變質(zhì)真菌產(chǎn)生的毒素引起的中毒,94,,真菌毒素的快速分析方法主要有： 親和色譜法 酶聯(lián)免疫吸附法,95,親和色譜法是利用生物分子間所具有的專一親和力而設(shè)計的層析技術(shù)。 酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)是一種將抗原抗體免疫反應(yīng)的特異性和酶的高效催化作用有機(jī)地結(jié)合起來用于檢測的免疫技術(shù)。--既可用于檢測抗原，又可檢測抗體，ELISA法可進(jìn)行定性和定量測定。,96,1.黃曲霉毒素快速分析技術(shù) 黃曲霉毒素是主要由黃曲霉 (aspergillus flavus) 寄生曲霉 (a.parasiticus) 產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，在濕熱地區(qū)食品和飼料中出現(xiàn)黃曲霉毒素的機(jī)率最高。 黃曲霉毒素的相對分子量為312-346。難溶于水,易溶于油,甲醇,丙酮和氯仿等有機(jī)溶劑,但不溶于石油醚,己烷和乙醚中。一般在中性溶液中較穩(wěn)定,但在強(qiáng)酸性溶液中稍有分解,在pH9-10的強(qiáng)堿溶液中分解迅速。其純品為無色結(jié)晶,耐高溫,黃曲霉毒素B1的分解溫度為268℃,97,,1993年黃曲霉毒素被食品衛(wèi)生組織(WHO)的癌癥研究機(jī)構(gòu)劃定為1類致癌物,是一種毒性極強(qiáng)的劇毒物質(zhì)，其毒性相當(dāng) 氰化鉀的10倍，砒霜的68倍。 黃曲霉毒素屬肝臟毒，抑肝臟蛋白質(zhì)的合成，引發(fā)不同類型的肝臟疾病。嚴(yán)重時可導(dǎo)致肝癌甚至死亡。 在天然污染的食品中以黃曲霉毒素B1最為多見,其毒性和致癌性也最強(qiáng)。,98,黃曲霉毒素的種類和結(jié)構(gòu) 目前已發(fā)現(xiàn)的黃曲霉毒素相關(guān)化合物有B1、B2、G1、G2、B2a、G2a、M1、M2、P1等十二種左右 。 基本結(jié)構(gòu)都是二氫呋喃氧雜萘鄰?fù)难苌?，即結(jié)構(gòu)中含有一個二 呋喃環(huán)和一個氧雜萘鄰?fù)?香豆素)。前者為基本毒性結(jié)構(gòu)，后者與致癌有關(guān)。M1是黃曲霉毒素B1在體內(nèi)經(jīng)過羥化而衍生成的代謝產(chǎn)物。黃曲霉毒素的主要分子型式含 B1、B2、G1、G2 ，M1、M2等。其中M1和M2 主要存在于牛奶中。B1為毒性及致癌性最強(qiáng)的物質(zhì)。 B1和G1的二呋喃環(huán)末端有雙鍵。二呋喃環(huán)末端有雙鍵者毒性較強(qiáng)并有致癌性。其中B1毒性及致癌性最強(qiáng)。 B1在食品中的污染最廣泛，對食品的安全性影響最大，在食品衛(wèi)生監(jiān)測中，以它作為污染指標(biāo)。,99,,各種黃曲霉毒素的結(jié)構(gòu),100,（1）免疫親和柱法,原理：試樣中的黃曲霉毒素用一定比例的甲醇/水提取液經(jīng)過過濾，稀釋后，用免疫親和柱凈化，以甲醇將親和柱上的黃曲霉毒素淋洗下來，在淋洗液中加入溴溶液衍生，以提高測定靈敏度，然后用熒光分光光度計進(jìn)行定量；也可以將甲醇-黃曲霉毒素淋洗液的一部分注入HPLC中，對黃曲霉毒素B1,B2,G1,B2分別進(jìn)行定量分析。免疫親和柱是用大劑量的黃曲霉毒素單克隆抗體固化在水不溶性的載體上，然后裝柱而成。該方法的測定范圍0-300ug/kg。,101,黃曲霉毒素免疫親和柱-熒光光度計法克服了TLC和HPLC法在操作過程中使用劇毒的黃曲霉毒素作為標(biāo)定標(biāo)準(zhǔn)物，極少使用有機(jī)溶劑，操作方便，耗時少。一個樣品只需10-15min,比傳統(tǒng)方法快幾個小時甚至幾天時間;儀器設(shè)備輕便容易攜帶,自動化程度高 ,操作簡單,直接讀出測試結(jié)果,可以在小型實驗或現(xiàn)場使用?？梢赃M(jìn)行黃曲霉毒素總量 (B1B2G1G2) 的測定,檢測限可達(dá)到1ug/kg,達(dá)到黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)限量值以下測定范圍為1-300ug/kg.,102,免疫親和柱—熒光分光光度法,1.程序試樣經(jīng)過甲醇—水提取，提取液經(jīng)過濾、稀釋后，濾液經(jīng)過含有黃曲霉毒素特異抗體的免疫親和層析凈化，此抗體對黃曲霉毒素 B1、B2、G1、G2具有專一性，黃曲霉毒素交聯(lián)在層析介質(zhì)中的抗體上。用水將免疫親和柱上雜質(zhì)除去，以甲醇通過免疫親和層析柱洗脫，加入溴溶液衍生，以提高測定靈敏度。洗脫液通過熒光光度計測定黃曲霉毒素(B1、B2、G1、G2)總量。,103,2.分析步驟,(1)提取大米、玉米、小麥、花生及其制品:準(zhǔn)確稱取經(jīng)過磨細(xì)(粒度小于 2 mm)的試樣 25. 0 g于250 mL具塞錐形瓶中，加入 5. 0 g氯化鈉及甲醇一水(7+3)至 125.0 mL(V1)，以均質(zhì)器高速攪拌提取2 min。定量濾紙過濾，準(zhǔn)確移取 15.0 mL(V2)濾液并加入 30.0 mL(V3)水稀釋，用玻璃纖維濾紙過濾1-2次，至濾液澄清，備用。植物油脂:準(zhǔn)確稱取試樣 25. 0 g于 250 mL具塞錐形瓶中，加人 5.0 g氯化鈉及加入甲醇一水(7+3)至 125.0 mL(V1)，以均質(zhì)器高速攪拌提取 2 min。定量濾紙過濾，準(zhǔn)確移取 15.0 mL(V2)濾液并加入 30. 0 mL(V3)水稀釋，用玻璃纖維濾紙過濾 1-2次，至濾液澄清，備用。,104,(2)凈化1) 大米、玉米、小麥、花生及其制品、植物油脂:將免疫親和柱連接于 20.0 mL玻璃注射器下。準(zhǔn)確移取 15.0 mL(V4)樣品提取液注入玻璃注射器中，將空氣壓力泵與玻璃注射器連接，調(diào)節(jié)壓力使溶液以約 6 mL/min流速緩慢通過免疫親和柱，直至 2 mL-3 mL空氣通過柱體。以10 mL水淋洗柱子兩次，棄去全部流出液，并使 2 mL-3 mL空氣通過柱體。準(zhǔn)確加入 1.0 mL(V)色譜級甲醇洗脫，流速為 1 mL/min-2 mL/min，收集全部洗脫液于玻璃試管中，供檢測用。,105,(3)測定,1)熒光光度計校準(zhǔn)在激發(fā)波長 360 nm，發(fā)射波長450 nm 條件下，以0.05 mol/L硫酸溶液為空白，調(diào)節(jié)熒光光度計的讀數(shù)值為 0.0μg/L;以熒光光度計校準(zhǔn)溶液調(diào)節(jié)熒光光度計的讀數(shù)值為 20.0 μg/L。 2)樣液測定取上述凈化后的甲醇洗脫液加入1.0 mL 0.002 %溴溶液，混勻，靜置1 min，按上述條件進(jìn)行操作，于熒光光度計中讀取樣液中黃曲霉毒素B1+B2+G1+G2)的濃度C(μg/L)。 3) 空白試驗用水代替試樣，按提取和凈化步驟做空白試驗。 4) 結(jié)果計算,106,酶聯(lián)免疫吸附劑（ELISA）試劑盒是依據(jù)GB/T5009.22-2003第二法的原理制成的，測定的實質(zhì)是采用酶標(biāo)記的抗體或抗原與樣品中的抗原或抗體間進(jìn)行的抗原—抗體反應(yīng)，加入顯色液后，通過目測觀察顏色來做快速的半定量的結(jié)果分析。測定原理：樣品中的AFTB1經(jīng)提取、脫脂、濃縮后與定量的特異性抗體（抗黃曲霉毒素 B1單克隆抗體）反應(yīng)，多余的游離抗體則與酶標(biāo)板內(nèi)的包被抗原（AFB1-BSA人工抗原）結(jié)合，加入酶標(biāo)記物和底物后顯色，與標(biāo)準(zhǔn)比較測定含量。,（2）酶聯(lián)免疫吸附劑（ELISA）,107,所用抗原抗體：抗體：抗黃曲霉毒素B1的單克隆抗體（或抗血清）包被抗原：黃曲霉毒素B1與載體蛋白（牛血清蛋白）的結(jié)合物酶標(biāo)二抗：羊抗鼠IgG與辣根過氧化物酶結(jié)合物,108,測定步驟： 1.樣品中AFB1的提取,(1)大米和小麥（脂肪含量＜3.0％）：樣品粉碎后過20目篩，稱取20.0g，加入250m1具塞錐形瓶中。準(zhǔn)確加入60mL三氯甲烷，蓋塞后滴水封嚴(yán)，150rpm振蕩30min。靜置后，用快速定性濾紙過濾于50mL燒杯中，立即取12mL濾液（相當(dāng)4.0g樣品）于75mL蒸發(fā)皿中。65℃水浴通風(fēng)揮干。用2.0mL甲醇一PBS (20+80)分三次（0.8mL、0.7mL、0.5mL）溶解并徹底沖洗蒸發(fā)皿中凝結(jié)物，移至小試管加蓋振蕩后靜置待測。此液每毫升相當(dāng)2.0g樣品。,109,(2)玉米（脂肪含量3.0～5.0％）：樣品粉碎后過20目篩，稱取20.0g，加入250mL具塞錐形瓶中。準(zhǔn)確加入50.0mL甲醇一水（80+20）溶液和15.0mL石油醚，蓋塞后滴水封嚴(yán)，150rpm振蕩30min。用快速定性濾紙過濾于125mL分液漏斗中,待分層后，放出下層甲醇水溶液于50mL燒杯內(nèi)，從中取10.0mL （相當(dāng)于4.0g樣品）于75mL蒸發(fā)皿中,以下按上述“65℃水浴通風(fēng)揮干”起，依法操作。,110,(3)花生（脂肪含量15.0-45.0％）：樣品去殼去皮粉碎后稱取20.0g，加入250mL具塞三角瓶中，準(zhǔn)確加入100.0mL甲醇水(55 ＋45）溶液和30mL石油醚,蓋塞后滴水封嚴(yán)，150rpm振蕩30min，靜置15min后用快速定性濾紙過濾于125mL分液漏斗中，待分層后，放出下層甲醇水溶液于100mL燒杯內(nèi)，從中取20.0 mL（相當(dāng)于4.0g樣品）置于另一125mL分液漏斗中，加入20.0mL三氯甲烷，振搖2min，靜置分層（如有乳化現(xiàn)象可滴加甲醇促使分層）。放出三氯甲烷于75mL蒸發(fā)皿中，再加5.0mL三氯甲烷于分液漏斗中重復(fù)振搖提取后，放出三氯甲烷層一并于蒸發(fā)皿中，以下按上述“65℃水浴通風(fēng)揮干”起，依法操作。,111,(4)植物油：用小燒杯稱取4.0g樣品，用20.0mL石油醚，將樣品移于125mL分液漏斗中，用20.0mL 甲醇水(55 ＋45）溶液分次洗燒杯，溶液一并移人分液漏斗中。（精煉油4.0g樣為4.575mL，可直接用移液器加入分液漏斗再加溶劑后振搖）振搖2min，靜置分層后，放出下層甲醇水溶液于750mL蒸發(fā)皿中。再用5.0mL甲醇水溶液重復(fù)振搖提取一次，提取液一并加入蒸發(fā)皿中，以下按自“65℃水浴通風(fēng)揮干”起，依法操作。(5)其它食品：可按照GB5009有關(guān)章節(jié)提供的方法操作，最終提取物（相當(dāng)于4.0g樣品）應(yīng)收集于2.0m1甲醇一PBS(20＋80)中。,112,2.間接競爭性酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA),(1)包被微孔板： 用AFB1-BSA人工抗原包被酶標(biāo)板，100μL/孔，4℃過夜。 (3)封閉：已包被的酶標(biāo)板用洗液洗3次，每次3min后，加封閉液封閉，250μL/孔，置37℃下1h。,113,(3)抗體抗原反應(yīng)：將黃曲霉毒素B1純化單克隆抗體稀釋倍后分別 a.與等量不同濃度的黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液用2mL試管混合振蕩后，4℃靜置。此液用于制作黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線。 b.與等量樣品提取液用2mL試管混合振蕩后，4℃靜置。此液用于測定樣品中黃曲霉毒素B1含量。酶標(biāo)板洗3×3min后，加抗體抗原反應(yīng)液，以抗體稀釋液為陰性對照，空白對照，130μL/孔 ，37℃，2h。,114,(4)酶標(biāo)記反應(yīng)：酶標(biāo)板洗3×3min，加酶標(biāo)二抗(1∶200，V/V)100μL/孔，1h。 (5)顯色反應(yīng)： 酶標(biāo)板用洗液洗5×3min。加底物溶液(10mgOPD)加25mL底物緩沖液加37μL30%H2O2，100μL/孔，37℃，15min。 (6)終止：加2mol/LH2SO4，40μL/孔，以終止顯色反應(yīng)。 (7)測定：酶標(biāo)儀490nm測出OD值。,115,3.數(shù)據(jù)處理及計算結(jié)果,(1)求出各孔的0D校正值：0D校正值＝OD實測值一空白對照孔0D值（均值）。(2)求出待測樣的0D％值：0D％＝[OD校正值/陰性對照孔0D校正值（均值）］× 100％。(3)求出待測樣AFB1含量（ng／g）：在標(biāo)準(zhǔn)競爭抑制曲線上找到待測樣0D％值（座標(biāo)Y值）的對應(yīng)點，該點座標(biāo)X值的反對數(shù)（10x）即為樣品中AFB1的含量（ng／g）,116,免疫親和柱法和酶聯(lián)免疫吸附法雖然都可達(dá)到快速簡便效果,但酶聯(lián)免疫吸附法僅能檢測單一毒素(如黃曲霉毒素B1)含量,而且易出現(xiàn)假陽性結(jié)果,難以控制。免疫親和柱法(包括熒光光度法和HPLC法)卻能達(dá)到既定量準(zhǔn)確又快速簡便的要求。,117,（3）金標(biāo)試紙法,利用競爭性免疫分析原理設(shè)計。 ?氯金酸在還原劑作用下，可聚合成一定大小的金顆粒，形成帶負(fù)電的疏水膠溶液。由于靜電作用而成為穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，故稱膠體金。 膠體金標(biāo)記，實質(zhì)上是蛋白質(zhì)等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過程。,118,,膠體金檢測條在臨床診斷中廣泛使用。方法成熟，使用簡便。 關(guān)鍵是制備單克隆抗體，然后與膠體金交聯(lián)，在親水紙層析條上固定。,119,檢測原理:將特異性的抗原或抗體以條帶狀固定在膜上，膠體金標(biāo)記試劑（抗體或單克隆抗體）吸附在結(jié)合墊上，當(dāng)待檢樣本加到試紙條一端的樣本墊上后，通過毛細(xì)作用向前移動，溶解結(jié)合墊上的膠體金標(biāo)記試劑后相互反應(yīng)，再移動至固定的抗原或抗體的區(qū)域時，待檢物與金標(biāo)試劑的結(jié)合物又與之發(fā)生特異性結(jié)合而被截留，聚集在檢測帶上，可通過肉眼觀察到顯色結(jié)果。,120,,試紙條由樣品墊、金標(biāo)墊、硝酸纖維膜和樣品吸收墊四部分組成(下圖)。,121,操作流程：,122,A：陰性。對照線(C)和測試線(T)同時存在，表明樣品中無黃曲霉毒素。 B：陽性。只有對照線(C)，無樣品測試線(T)。表明樣品中含有高濃度的黃曲霉毒素。 C：無效結(jié)果。對照線(C)和測試線(T)都不存在。,A：陰性,B：陽性,C 無效結(jié)果,樣品處理,比色,,123,,該方法是利用單克隆抗體而設(shè)計的固相免疫分析法。由此產(chǎn)生的一步式AFT快速檢測紙法可在5-10 min完成對樣品中AFT的定性測定。借助AFT標(biāo)準(zhǔn)樣品，能估算AFT的含量，非常適用于現(xiàn)場測試和進(jìn)行大量樣品時初選，實現(xiàn)快速檢測的目的。,124,2.黃曲霉毒素M1快速測定技術(shù) ?黃曲霉毒素M1，是動物攝入黃曲霉毒素B1后在體內(nèi)經(jīng)經(jīng)基化代謝的產(chǎn)物，黃曲霉毒素M1的毒性和致癌性與黃曲霉毒素B1的基本相似。 快速測定法： 免疫親和柱凈化 一熒光計測定法。 免疫親和柱凈化一高效液相色譜法。,125,(1)免疫親和柱凈化一熒光計快速測定法 試樣經(jīng)過離心、脫脂、過柱后，濾液經(jīng)過結(jié)合有黃曲霉毒素M1特殊抗體的免疫親和柱凈化，此抗體對黃曲霉毒素M1有專一識別能力，黃曲霉毒素M1鍵合在分離柱中的抗體。用甲醇-水(10：90)將免疫親和柱上雜質(zhì)除去，以甲醇-水(80:20)通過分離柱洗脫，加入溴溶液衍生，以提高測定靈敏度。衍生化后的洗脫液于熒光光度計中測定黃曲霉毒素M1。,126,①適用于測定牛奶、奶粉，以及低脂牛奶、脫脂牛奶、黃曲霉毒素M1的含量。奶粉中的最低檢測限是0.08μg/kg ，牛奶中的最低檢測限是0.008μg/kg。,127,②試樣通過免疫親和柱時，黃曲霉毒素M1被提取，親和在固體支持物上。當(dāng)樣品通過親和柱時，抗體選擇性地與所有存在的黃曲霉毒素抗原結(jié)合，形成抗體-抗原復(fù)合體。用淋洗液將親和柱上的黃曲霉毒素M1洗脫下來，收集洗脫液。用液相色譜儀(HPLC)測定洗脫液中黃曲霉毒素M1含量。,128,赭曲霉毒素的檢測方法包括:酶聯(lián)免疫吸附法薄層色譜法HPLC免疫親和柱-熒光法免疫親和柱-HPLC法等。酶聯(lián)免疫吸附測定法有直接法和間接法。,3.赭曲霉毒素快速檢測技術(shù),129,伏馬菌素的檢測方法主要有: 免疫親和柱 免疫親和-HPLC法 毛電泳電泳法 液相-質(zhì)譜法,4.伏馬菌素的快速檢測,南非與中國某些地區(qū)食管癌高發(fā)與吃此類毒素污染的玉米有關(guān),130,二、食品中金屬污染物的快速檢測—微波溶樣快速測定法,? 微波加熱是直接通過物質(zhì)吸收微波能量來達(dá)到快速加熱的目的，用密閉容器又能同時獲得高溫、高壓，這樣不僅能提高反應(yīng)的速率，而且還可以提高試樣的分解能力，以達(dá)到理想的消解效果。 在微波體系中，樣品分解要受到許多復(fù)雜因素的影響，其中樣品溶劑的選擇非常重要。大多數(shù)無機(jī)酸都是良好的微波吸收體，某些酸在密閉容器中經(jīng)微波作用后其穩(wěn)定性、蒸汽壓等性質(zhì)都會引起不同的變化 適合于原子吸收光譜分析中的樣品預(yù)處理。,131,,將密封微波溶樣技術(shù)與原子吸收光譜分析緊密地結(jié)合起來可以實現(xiàn)快速準(zhǔn)確測定金屬污染物。 密封微波溶樣技術(shù)作為一種樣品預(yù)處理手段，可以使這一過程更加快速、準(zhǔn)確、安全。,132,?樣品經(jīng)微波消解后，注入原子吸收分光光度計石墨爐中，電熱原子化后吸收283.3nm共振線，在一定濃度范圍，其吸收值與鉛含量成正比，與標(biāo)準(zhǔn)系列比較定量。,1.食品中鉛的快速檢驗—微波消化-原子吸收分光光度法,133,2.食品中鎘的快速檢驗—微波消化-原子吸收分光光度法 ? 樣品經(jīng)微波消解后，注人原子吸收分光光度計石墨爐中，電熱原子化后吸收228.8nm共振線，在一定濃度范圍，其吸收值與鎘含量成正比，與標(biāo)準(zhǔn)系列比較定量。,134,? 樣品經(jīng)微波消解后，在酸性介質(zhì)中，樣品溶液中的砷與硼氫化鉀或硼氫化鈉（NaBH4)反應(yīng)在氫化物發(fā)生系統(tǒng)中生成砷化氫，過量氫氣和砷化氫與載氣(氬氣)混合，進(jìn)人原子化器。氫氣和氫氣在特制點火裝置的作用下形成氬氫火焰，使待測元素原子化。砷空心陰極燈發(fā)射的特征譜線通過聚焦，激發(fā)氫氫焰中砷原子，基態(tài)原子被激發(fā)至高能態(tài)，在由高能態(tài)回到基態(tài)時，發(fā)射出特征波長的原子熒光，其熒光強(qiáng)度與樣品中砷的濃度成正比，再與標(biāo)準(zhǔn)系列比較定量。,3.食品中砷的快速檢驗—微波消化-原子 熒光分光光度法,135,樣品經(jīng)酸加熱消化后，在酸性介質(zhì)中，樣品溶液中的汞與硼氫化鉀或硼氫化鈉 (NaBH4)反應(yīng)，在氫化物發(fā)生系統(tǒng)中生成原子態(tài)汞蒸氣，過量氫氣和汞蒸氣與載氣 (氬氣)混合，進(jìn)入原子化器，氫氣和氫氣在特制點火裝置的作用下形成氬氫火焰，使待測元素原于化。汞空心陰極燈發(fā)射的特征譜線通過聚焦，激發(fā)氬氫火焰中汞原子，基態(tài)原子被激發(fā)至高能態(tài)，在由高能態(tài)回到基態(tài)時，發(fā)射出特征波長的原子熒光，其熒光強(qiáng)度與樣品中汞的濃度成正比，再與標(biāo)準(zhǔn)系列比較定量。,4.食品中汞的快速檢臉—微波消化-原子熒 光分光光度法,136,1.簡介:亞硝酸鹽主要是指亞硝酸鈉和亞硝酸鉀，是一種白色不透明結(jié)晶的化工產(chǎn)品，形狀極似食鹽，亞硝酸鹽是劇毒物質(zhì)，成人攝入0.2-0.5克即可引起中毒，3克即可致死。,,三、亞硝酸鹽快速測定（速測盒法）,137,亞硝酸鹽是一種致癌物質(zhì)；對胎兒有致畸作用；嬰兒“高鐵血紅蛋白癥”,2.亞硝酸鹽的危害性,138,,3.原理:將試劑作成藥片。亞硝酸鹽與藥片中的對氨基苯磺酰胺重氮化后，再與藥片中的鹽酸N-(1-萘基)乙二胺偶合，形成玫瑰紅色偶氮染料，顏色的深度與亞硝酸鹽的濃度成正比，與標(biāo)準(zhǔn)色卡比較定量。,139,取食鹽1平勺（約0.1g），加入到檢測管中，加純凈水至1mL刻度處，搖溶，10min后與標(biāo)準(zhǔn)色板對比，該色板上的數(shù)值乘上10即為食鹽中亞硝酸鹽的含量mg/kg。當(dāng)樣品出現(xiàn)血紅色且有沉淀產(chǎn)生或很快退色變成黃色時，可判定亞硝酸鹽含量相當(dāng)高，或樣品本身就是亞硝酸鹽。,140,液體樣品的檢測：取1mL液體樣品加入到檢測管中，操作方法與上相同，與標(biāo)準(zhǔn)色板對比，該色板上的數(shù)值即為樣品中亞硝酸鹽的mg/kg含量。液態(tài)奶屬于乳濁液，具有將近1倍的折色特性，所得結(jié)果乘以2即為樣品中亞硝酸鹽的近似含量mg/L。,141,固體或半固體樣品的檢測： 取均勻的樣品（如香腸）1.0g 至10mL比色管中，加純凈水至10mL，充分震搖后放置，取上清液或濾液 1mL加入到檢測管中(乳粉溶解后不用過濾，直接取乳濁液加入到檢測管中)，將試劑搖溶，10min 后與標(biāo)準(zhǔn)色板對比，找出顏色相同或相近的色階，該色階上的數(shù)值乘上10 即為樣品中亞硝酸鹽的mg/kg含量。如果測試結(jié)果超出色板上的最高值，可將樣品再稀釋10倍，測試結(jié)果乘上100即為樣品中亞硝酸鹽的含量。,142,注意事項(1)亞硝酸鹽含量較高時，試劑顯紅色后不久會變?yōu)辄S色，將黃色溶液再稀釋放入另一新的速測管中又會顯出紅色，由此區(qū)分是亞硝酸鹽還是食用鹽。(2)當(dāng)樣品反應(yīng)后的顏色大于標(biāo)準(zhǔn)色板2.00mg/L色階時，應(yīng)將樣品稀釋后再測，計算結(jié)果時乘上稀釋倍數(shù)。(3)生活飲用水中常有亞硝酸鹽存在，不宜作為測定用稀釋液。,案例：某加工點 在往鹵味食制品 中加入亞硝酸鈉,143,四、硝酸鹽試紙快速檢測方法,國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局發(fā)布的農(nóng)產(chǎn)品安全質(zhì)量8項系列標(biāo)淮2001年10月1日正式實施。其中，水果和蔬菜農(nóng)產(chǎn)品中硝酸鹽和亞硝酸鹽的限量，作為重要指標(biāo)列入。同時(亞)硝酸鹽的限量指標(biāo)在肉制品、魚(鮮)、肉類(鮮)、蛋類(鮮)、醬腌菜、乳粉、食鹽、肉類罐頭、糧食(大米、面粉、玉米)等食品中和水質(zhì)分析中均有國家標(biāo)準(zhǔn)要求。 在蔬菜品質(zhì)方面硝酸鹽含量是衛(wèi)生(安全)品質(zhì)的一項重要指標(biāo)。,144,,檢測意義： 常見的硝酸鹽有硝酸鈉、硝酸鉀、硝酸銨和農(nóng)業(yè)氮素化肥轉(zhuǎn)化的硝酸鹽等。某些地區(qū)，由于常年施用氮素化肥，致使蔬菜瓜果以及牲畜飼料中硝酸鹽的含量較高。硝酸鹽本身的毒性并不大，但進(jìn)入人體后，會因腸道細(xì)菌的作用轉(zhuǎn)化生成一些亞硝酸鹽或胺類物質(zhì)對人體構(gòu)成危害。,145,2.硝酸鹽含量的測定方法：(1)直接測定NO3-法;(2)硝酸鹽還原法 即還原為NO22-和NH4+，或 NO和還原物的測定;(3)非直接法 以N03-與化學(xué)物質(zhì)反應(yīng)形成一種化合物的濃度變化來測定N03-濃度。非直接法有原子吸收法(AAS)和極譜儀法。我國標(biāo)準(zhǔn)方法GB5009.33-1996和GB/T15401-1994使用的是硝酸鹽還原比色法，但操作煩瑣。,