生物化學(xué)：10 DNA的生物合成

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1、DNARNA蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)復(fù)制復(fù)制轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄翻譯翻譯逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄RNA翻譯翻譯(RNA病毒病毒)DNA的生物合成的生物合成( (復(fù)制復(fù)制) )DNA Biosynthesis，Replication 第第 十十 章章復(fù)制復(fù)制( (replication)是指遺傳物質(zhì)的傳代，以母鏈?zhǔn)侵高z傳物質(zhì)的傳代，以母鏈DNA為模板合成子鏈為模板合成子鏈DNA的過程。的過程。復(fù)制復(fù)制親代親代DNA子代子代DNA復(fù)制的基本規(guī)律復(fù)制的基本規(guī)律Basic Rules of DNA Replication 第一節(jié)第一節(jié)l復(fù)制的方式復(fù)制的方式半保留復(fù)制半保留復(fù)制(semi-conservative replication)

2、l復(fù)制的高保真性復(fù)制的高保真性(high fidelity) l雙向復(fù)制雙向復(fù)制(bidirectional replication)l半不連續(xù)復(fù)制半不連續(xù)復(fù)制(semi-discontinuous replication) 一、半保留復(fù)制的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和意義一、半保留復(fù)制的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和意義 DNA生物合成時(shí)，母鏈生物合成時(shí)，母鏈DNA解開為兩股解開為兩股單鏈，各自作為模板單鏈，各自作為模板(template)按堿基配對(duì)按堿基配對(duì)規(guī)律，合成與模板互補(bǔ)的子鏈。子代細(xì)胞的規(guī)律，合成與模板互補(bǔ)的子鏈。子代細(xì)胞的DNA，一股單鏈從親代完整地接受過來，另，一股單鏈從親代完整地接受過來，另一股單鏈則完全從新合成

3、。兩個(gè)子細(xì)胞的一股單鏈則完全從新合成。兩個(gè)子細(xì)胞的DNA都和親代都和親代DNA堿基序列一致。這種復(fù)制堿基序列一致。這種復(fù)制方式稱為方式稱為半保留復(fù)制半保留復(fù)制。半保留復(fù)制的概念半保留復(fù)制的概念A(yù)GGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGTCCATGACTCCATGACAGGTACTGAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+母鏈母鏈DNA 復(fù)制過程中形復(fù)制過程中形成的復(fù)制叉成的復(fù)制叉子代子代DNA 子鏈繼承母鏈遺傳信息的幾種可能方式子鏈繼承母鏈遺傳信息的幾

4、種可能方式 全保留式全保留式 半保留式半保留式 混合式混合式 密度梯度實(shí)驗(yàn)密度梯度實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持半保留復(fù)制半保留復(fù)制的設(shè)想。的設(shè)想。含重氮含重氮(15N)-DNA的細(xì)菌的細(xì)菌培養(yǎng)于普培養(yǎng)于普通培養(yǎng)液通培養(yǎng)液 第一代第一代繼續(xù)培養(yǎng)于繼續(xù)培養(yǎng)于普通培養(yǎng)液普通培養(yǎng)液 第二代第二代梯度離心結(jié)果梯度離心結(jié)果按半保留復(fù)制方式，子代按半保留復(fù)制方式，子代DNA與與親代親代DNA A的的堿基序列一致堿基序列一致，即子代，即子代保留了親代的全部遺傳信息，體現(xiàn)保留了親代的全部遺傳信息，體現(xiàn)了遺傳的了遺傳的保守性保守性。半保留復(fù)制的意義半保留復(fù)制的意義遺傳的保守性，是物種穩(wěn)定性的分遺傳的保守性，是物

5、種穩(wěn)定性的分子基礎(chǔ)，但子基礎(chǔ)，但不是絕對(duì)的不是絕對(duì)的。原核生物復(fù)制時(shí)，原核生物復(fù)制時(shí)，DNA從從起始點(diǎn)起始點(diǎn)(origin)向兩個(gè)方向解鏈，形成兩個(gè)延伸向兩個(gè)方向解鏈，形成兩個(gè)延伸方向相反的復(fù)制叉，稱為方向相反的復(fù)制叉，稱為雙向復(fù)制雙向復(fù)制。 二、雙向復(fù)制二、雙向復(fù)制A. 環(huán)狀雙鏈環(huán)狀雙鏈DNA及復(fù)制起始點(diǎn)及復(fù)制起始點(diǎn)B. 復(fù)制中的兩個(gè)復(fù)制叉復(fù)制中的兩個(gè)復(fù)制叉C. 復(fù)制接近終止點(diǎn)復(fù)制接近終止點(diǎn)(termination, ter)oriterA B C真核生物每個(gè)染色體有多個(gè)起始真核生物每個(gè)染色體有多個(gè)起始點(diǎn)，是多復(fù)制子的復(fù)制。點(diǎn)，是多復(fù)制子的復(fù)制。習(xí)慣上把兩個(gè)相鄰起始點(diǎn)之間的習(xí)慣上把兩個(gè)相鄰起

6、始點(diǎn)之間的距離定為一個(gè)距離定為一個(gè)復(fù)制子復(fù)制子(replicon) 。復(fù)。復(fù)制子是獨(dú)立完成復(fù)制的功能單位。制子是獨(dú)立完成復(fù)制的功能單位。 53oriorioriori535533553復(fù)制子復(fù)制子3三、復(fù)制的半不連續(xù)性三、復(fù)制的半不連續(xù)性3 5 3 5 解鏈方向解鏈方向3 5 3 3 5 領(lǐng)頭鏈領(lǐng)頭鏈(leading strand)隨從鏈隨從鏈(lagging strand)順著解鏈方向生成的子鏈，復(fù)制是連順著解鏈方向生成的子鏈，復(fù)制是連續(xù)進(jìn)行的，這股鏈稱為續(xù)進(jìn)行的，這股鏈稱為領(lǐng)頭鏈領(lǐng)頭鏈。另一股鏈因?yàn)閺?fù)制的方向與解鏈方向另一股鏈因?yàn)閺?fù)制的方向與解鏈方向相反，不能順著解鏈方向連續(xù)延長(zhǎng)，相反，不

7、能順著解鏈方向連續(xù)延長(zhǎng)，這股不連續(xù)復(fù)制的鏈稱為這股不連續(xù)復(fù)制的鏈稱為隨從鏈隨從鏈。復(fù)。復(fù)制中的不連續(xù)片段稱為制中的不連續(xù)片段稱為岡崎片段岡崎片段(okazaki fragment)。 領(lǐng)頭鏈連續(xù)復(fù)制而隨從鏈不連續(xù)復(fù)制領(lǐng)頭鏈連續(xù)復(fù)制而隨從鏈不連續(xù)復(fù)制，就是復(fù)制的，就是復(fù)制的半不連續(xù)性半不連續(xù)性。 DNA復(fù)制的酶學(xué)復(fù)制的酶學(xué)The Enzymology of DNA Replication第二節(jié)第二節(jié)參與參與DNA復(fù)制的物質(zhì)復(fù)制的物質(zhì) 底物底物(substrate): dATP, dGTP, dCTP, dTTP聚合酶聚合酶(polymerase): 依賴依賴DNA的的DNA聚聚合酶，簡(jiǎn)寫為合酶，

8、簡(jiǎn)寫為 DNA-pol模板模板(template) : 解開成單鏈的解開成單鏈的DNA母鏈母鏈引物引物(primer): 提供提供3 -OH末端使末端使dNTP可可以依次聚合的一段核酸鏈以依次聚合的一段核酸鏈其他的酶和蛋白質(zhì)因子其他的酶和蛋白質(zhì)因子一、復(fù)制的化學(xué)反應(yīng)一、復(fù)制的化學(xué)反應(yīng) (dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 + PPi 聚合反應(yīng)的特點(diǎn)聚合反應(yīng)的特點(diǎn)DNA 新鏈生成需新鏈生成需引物引物和和模板模板； 新鏈的延長(zhǎng)只可沿新鏈的延長(zhǎng)只可沿5 3 方向進(jìn)行方向進(jìn)行 。二、二、DNA聚合酶聚合酶全稱：全稱：依賴依賴DNA的的DNA聚合酶聚合酶 (DNA-dependent DNA

9、 polymerase)簡(jiǎn)稱：簡(jiǎn)稱：DNA-pol活性：活性：1. 53 的聚合活性的聚合活性 2. 核酸外切酶活性核酸外切酶活性5 A G C T T C A G G A T A 3 | | | | | | | | | | |3 T C G A A G T C C T A G C G A C 5 3 5 外切酶活性外切酶活性 5 3 外切酶活性外切酶活性?能切除突變的能切除突變的 DNA片段。片段。能辨認(rèn)錯(cuò)配的堿基對(duì)，并將其水解。能辨認(rèn)錯(cuò)配的堿基對(duì)，并將其水解。 核酸外切酶活性核酸外切酶活性 （一）原核生物的（一）原核生物的DNA聚合酶聚合酶DNA-pol DNA-pol DNA-pol （

10、一）原核生物的（一）原核生物的DNA聚合酶聚合酶可能可能不可能不可能可能可能基因突變后的致死性基因突變后的致死性無無無無有有5 3 核酸外切酶活性核酸外切酶活性20？400分子數(shù)分子數(shù)/細(xì)胞細(xì)胞多亞基不對(duì)稱多亞基不對(duì)稱二聚體二聚體？單肽鏈單肽鏈組成組成250120109分子量分子量(kD)DNA-pol IIIDNA-pol IIDNA-pol I可能可能不可能不可能可能可能基因突變后的致死性基因突變后的致死性無無無無有有5 3 核酸外切酶活性核酸外切酶活性20？400分子數(shù)分子數(shù)/細(xì)胞細(xì)胞多亞基不對(duì)稱多亞基不對(duì)稱二聚體二聚體？單肽鏈單肽鏈組成組成250120109分子量分子量(kD)DNA-

11、pol IIIDNA-pol IIDNA-pol I功能功能：對(duì)復(fù)制中的錯(cuò)誤進(jìn)行校讀，對(duì)復(fù)制對(duì)復(fù)制中的錯(cuò)誤進(jìn)行校讀，對(duì)復(fù)制和修復(fù)中出現(xiàn)的空隙進(jìn)行填補(bǔ)。和修復(fù)中出現(xiàn)的空隙進(jìn)行填補(bǔ)。DNA-pol （109kD）323個(gè)氨基酸個(gè)氨基酸小片段小片段5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性大片段大片段/Klenow 片段片段 604個(gè)氨基酸個(gè)氨基酸DNA聚合酶活性聚合酶活性 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性N 端端C 端端木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶DNA-pol Klenow片段是實(shí)驗(yàn)室合成片段是實(shí)驗(yàn)室合成DNA，進(jìn)行，進(jìn)行分子生物學(xué)研究中常用的工具酶。分子生物學(xué)研究中常用的工具酶。 DNA-pol （120kD）

12、 DNA-pol II基因發(fā)生突變，細(xì)菌依基因發(fā)生突變，細(xì)菌依然能存活。然能存活。 它參與它參與DNA損傷的應(yīng)急狀態(tài)修復(fù)。損傷的應(yīng)急狀態(tài)修復(fù)。 功能功能是原核生物復(fù)制延長(zhǎng)中真正起催化是原核生物復(fù)制延長(zhǎng)中真正起催化作用的酶。作用的酶。 DNA-pol (250kD)（二）真核生物的（二）真核生物的DNADNA聚合酶聚合酶DNA-pol 起始引發(fā)，有引物酶活性。起始引發(fā)，有引物酶活性。延長(zhǎng)子鏈的主要酶，有解螺旋酶活延長(zhǎng)子鏈的主要酶，有解螺旋酶活性。性。參與低保真度的復(fù)制參與低保真度的復(fù)制 。在復(fù)制過程中起校讀、修復(fù)和填在復(fù)制過程中起校讀、修復(fù)和填補(bǔ)缺口的作用。補(bǔ)缺口的作用。在在線粒體線粒體DNA復(fù)

13、制中起催化作用。復(fù)制中起催化作用。DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol 三、復(fù)制保真性的酶學(xué)依據(jù)三、復(fù)制保真性的酶學(xué)依據(jù)復(fù)制按照堿基配對(duì)規(guī)律進(jìn)行，是遺復(fù)制按照堿基配對(duì)規(guī)律進(jìn)行，是遺傳信息能準(zhǔn)確傳代的基本原理。傳信息能準(zhǔn)確傳代的基本原理。復(fù)制保真性的酶學(xué)機(jī)制：復(fù)制保真性的酶學(xué)機(jī)制：（一）（一）DNA-pol的核酸外切酶活性和的核酸外切酶活性和及時(shí)校讀及時(shí)校讀 （二）復(fù)制的保真性和堿基選擇（二）復(fù)制的保真性和堿基選擇A：DNA-pol的外切酶活性切除錯(cuò)配堿基；的外切酶活性切除錯(cuò)配堿基；并用其聚合活性摻入正確配對(duì)的底物。并用其聚合活性摻入正確配對(duì)的底物。B：堿基配對(duì)正確，：

14、堿基配對(duì)正確， DNA-pol不表現(xiàn)活性。不表現(xiàn)活性。（一）（一）DNA-pol的核酸外切酶活性和及時(shí)校讀的核酸外切酶活性和及時(shí)校讀（二）復(fù)制的保真性和堿基選擇（二）復(fù)制的保真性和堿基選擇 DNA聚合酶靠其大分子結(jié)構(gòu)協(xié)調(diào)非共價(jià)聚合酶靠其大分子結(jié)構(gòu)協(xié)調(diào)非共價(jià)（氫鍵）與共價(jià)（磷酸二酯鍵）鍵的有序（氫鍵）與共價(jià)（磷酸二酯鍵）鍵的有序形成。形成。 嘌呤的化學(xué)結(jié)構(gòu)能形成順式和反式構(gòu)型，嘌呤的化學(xué)結(jié)構(gòu)能形成順式和反式構(gòu)型，與相應(yīng)的嘧啶形成氫鍵配對(duì)，嘌呤應(yīng)處于與相應(yīng)的嘧啶形成氫鍵配對(duì)，嘌呤應(yīng)處于反式構(gòu)型反式構(gòu)型。 1. 遵守嚴(yán)格的堿基配對(duì)規(guī)律；遵守嚴(yán)格的堿基配對(duì)規(guī)律；2. 聚合酶在復(fù)制延長(zhǎng)時(shí)對(duì)堿基的選擇聚合

15、酶在復(fù)制延長(zhǎng)時(shí)對(duì)堿基的選擇功能；功能；3. 復(fù)制出錯(cuò)時(shí)復(fù)制出錯(cuò)時(shí)DNA-pol的及時(shí)校讀功的及時(shí)校讀功能。能。DNA復(fù)制的保真性至少要依賴三種機(jī)制復(fù)制的保真性至少要依賴三種機(jī)制 四、復(fù)制中的分子解鏈及四、復(fù)制中的分子解鏈及DNA 分子分子拓?fù)鋵W(xué)變化拓?fù)鋵W(xué)變化 DNA分子的堿基埋在雙螺旋內(nèi)部，分子的堿基埋在雙螺旋內(nèi)部，只有把只有把DNA解成單鏈，它才能起模板解成單鏈，它才能起模板作用。作用。（一）解螺旋酶、引物酶和單鏈（一）解螺旋酶、引物酶和單鏈DNA結(jié)合蛋白結(jié)合蛋白理順理順DNA鏈鏈拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶 (gyrA, B)穩(wěn)定已解開的單鏈穩(wěn)定已解開的單鏈單鏈單鏈DNA結(jié)合蛋白結(jié)合蛋白SSB催化

16、催化RNA引物生成引物生成引物酶引物酶DnaG (dnaG)運(yùn)送和協(xié)同運(yùn)送和協(xié)同DnaBDnaC (dnaC)解開解開DNA雙鏈雙鏈解螺旋酶解螺旋酶DnaB (dnaB)辨認(rèn)起始點(diǎn)辨認(rèn)起始點(diǎn)DnaA (dnaA)蛋白質(zhì)（基因）蛋白質(zhì)（基因）通用名通用名功能功能原核生物復(fù)制起始的相關(guān)蛋白質(zhì)原核生物復(fù)制起始的相關(guān)蛋白質(zhì)E. Coli 基因圖基因圖 解螺旋酶解螺旋酶(helicase)利用利用ATP供能，作用于氫鍵，使供能，作用于氫鍵，使DNA雙鏈解開成為兩條單鏈雙鏈解開成為兩條單鏈 引物酶引物酶(primase)復(fù)制起始時(shí)催化生成復(fù)制起始時(shí)催化生成RNA引物的酶引物的酶 單鏈單鏈DNA結(jié)合蛋白結(jié)合

17、蛋白(single stranded DNA binding protein, SSB)在復(fù)制中維持模板處于單鏈狀態(tài)并在復(fù)制中維持模板處于單鏈狀態(tài)并保護(hù)單鏈的完整保護(hù)單鏈的完整 1010 8 8 局部解鏈后局部解鏈后（二）（二）DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶 (DNA topoisomerase) 解鏈過程中正超螺旋的形成解鏈過程中正超螺旋的形成拓?fù)洚悩?gòu)酶作用特點(diǎn)拓?fù)洚悩?gòu)酶作用特點(diǎn)既能水解既能水解 、又能連接磷酸二酯鍵、又能連接磷酸二酯鍵 拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶分分 類類拓?fù)洚愅負(fù)洚悩?gòu)酶構(gòu)酶切斷切斷DNA雙鏈中雙鏈中一股一股鏈，使鏈，使DNA解鏈旋轉(zhuǎn)不致打結(jié)；適當(dāng)時(shí)候封解鏈旋轉(zhuǎn)不

18、致打結(jié)；適當(dāng)時(shí)候封閉切口，閉切口，DNA變?yōu)樗沙跔顟B(tài)變?yōu)樗沙跔顟B(tài)。反應(yīng)反應(yīng)不需不需ATP。拓?fù)洚愅負(fù)洚悩?gòu)酶構(gòu)酶切斷切斷DNA分子分子兩股兩股鏈，斷端通過鏈，斷端通過切口旋轉(zhuǎn)使超螺旋松弛。切口旋轉(zhuǎn)使超螺旋松弛。利用利用ATP供能，連接斷端，供能，連接斷端， DNA分子進(jìn)入負(fù)超螺旋狀態(tài)。分子進(jìn)入負(fù)超螺旋狀態(tài)。作用機(jī)制作用機(jī)制 五、五、DNA連接酶連接酶連接連接DNA鏈鏈3 -OH末端和相鄰末端和相鄰DNA鏈鏈5 -P末端，使二者生成磷酸二末端，使二者生成磷酸二酯鍵，從而把兩段相鄰的酯鍵，從而把兩段相鄰的DNA鏈連鏈連接成一條完整的鏈。接成一條完整的鏈。 DNA連接酶連接酶(DNA ligase)作

19、用方式作用方式POO-O-OHO5POO-O-O335DNA連接酶連接酶ATPADP5353DNA連接酶在復(fù)制中起最后接合缺連接酶在復(fù)制中起最后接合缺口的作用。口的作用。在在DNA修復(fù)、重組及剪接中也起縫修復(fù)、重組及剪接中也起縫合缺口作用。合缺口作用。也是基因工程的重要工具酶之一。也是基因工程的重要工具酶之一。功能功能DNA生物合成過程生物合成過程The Process of DNA Replication第三節(jié)第三節(jié)（一）復(fù)制的起始（一）復(fù)制的起始需要解決兩個(gè)問題：需要解決兩個(gè)問題：1. DNA解開成單鏈，提供模板。解開成單鏈，提供模板。2. 合成引物，提供合成引物，提供3 -OH末端。末端

20、。一、原核生物的一、原核生物的DNA生物合成生物合成 E.coli復(fù)制起始點(diǎn)復(fù)制起始點(diǎn) oriC GATTNTTTATTT GATCTNTTNTATT GATCTCTTATTAG 1 13 17 29 32 44 1 13 17 29 32 44 TGTGGATTA-TTATACACA-TTTGGATAA-TTATCCACA58 66 166 174 201 209 237 24558 66 166 174 201 209 237 245 串聯(lián)重復(fù)序列串聯(lián)重復(fù)序列 反向重復(fù)序列反向重復(fù)序列5 3 5 3 1. DNA解鏈解鏈 Dna A Dna B、 Dna CDNA拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶引物引

21、物酶酶SSB3 5 3 5 2. 引發(fā)體和引物引發(fā)體和引物含有解螺旋酶、含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物蛋白、引物酶和酶和DNA復(fù)制起始區(qū)域的復(fù)合結(jié)構(gòu)復(fù)制起始區(qū)域的復(fù)合結(jié)構(gòu)稱為引發(fā)體。稱為引發(fā)體。 3 5 3 5 引物是由引物酶催化合成的短鏈引物是由引物酶催化合成的短鏈RNA分子。分子。 引物引物3 HO5引物引物酶酶（二）復(fù)制的延長(zhǎng)（二）復(fù)制的延長(zhǎng)復(fù)制的延長(zhǎng)指在復(fù)制的延長(zhǎng)指在DNA-pol催化下，催化下，dNTP以以dNMP的方式逐個(gè)加入引物或的方式逐個(gè)加入引物或延長(zhǎng)中的子鏈上，其化學(xué)本質(zhì)是磷酸延長(zhǎng)中的子鏈上，其化學(xué)本質(zhì)是磷酸二酯鍵的不斷生成。二酯鍵的不斷生成。 5 5 3 35 5dATP

22、dGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH 33 3DNA-pol領(lǐng)頭鏈的合成領(lǐng)頭鏈的合成隨從鏈的合成隨從鏈的合成階段一階段一階段二階段二階段三階段三階段四階段四復(fù)復(fù)制制過過程程簡(jiǎn)簡(jiǎn)圖圖復(fù)復(fù) 制制 過過 程程 動(dòng)動(dòng) 畫畫 原核生物基因是環(huán)狀原核生物基因是環(huán)狀DNA，雙向復(fù)，雙向復(fù)制的復(fù)制片段在復(fù)制的終止點(diǎn)制的復(fù)制片段在復(fù)制的終止點(diǎn)(ter)處匯合。處匯合。oriter E.coli8232 ori terSV40500（三）復(fù)制的終止（三）復(fù)制的終止5 5 5 RNA酶酶OHP5 DNA-pol dNTP5 5 PATP ADP+Pi5 5 DNA連接酶連接酶 隨從鏈上不連續(xù)

23、性片段的連接隨從鏈上不連續(xù)性片段的連接哺乳動(dòng)物的哺乳動(dòng)物的細(xì)胞周期細(xì)胞周期DNA合成期合成期G1G2SM二、真核生物的二、真核生物的DNA生物合成生物合成 細(xì)胞能否分裂，決定于進(jìn)入細(xì)胞能否分裂，決定于進(jìn)入S期及期及M期這期這兩個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)。兩個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)。G1S及及G2M的調(diào)節(jié)，與的調(diào)節(jié)，與蛋白激酶活性有關(guān)。蛋白激酶活性有關(guān)。 蛋白激酶通過磷酸化激活或抑制各種復(fù)制蛋白激酶通過磷酸化激活或抑制各種復(fù)制因子而實(shí)施調(diào)控作用。因子而實(shí)施調(diào)控作用。 真核生物每個(gè)染色體有多個(gè)起始點(diǎn)，是多真核生物每個(gè)染色體有多個(gè)起始點(diǎn)，是多復(fù)制子復(fù)制。復(fù)制子復(fù)制。復(fù)制有時(shí)序性復(fù)制有時(shí)序性，即復(fù)制子以，即復(fù)制子以分組方式激活而不是同

24、步起動(dòng)。分組方式激活而不是同步起動(dòng)。 復(fù)制的起始需要復(fù)制的起始需要DNA-pol（引物酶活性）（引物酶活性）和和pol（解螺旋酶活性）參與。還需拓?fù)涿福ń饴菪富钚裕﹨⑴c。還需拓?fù)涿负蛷?fù)制因子和復(fù)制因子(replication factor, RF)。 增殖細(xì)胞核抗原增殖細(xì)胞核抗原(proliferation cell nuclear antigen, PCNA)在復(fù)制起始和延長(zhǎng)中起關(guān)鍵在復(fù)制起始和延長(zhǎng)中起關(guān)鍵作用。作用。 （一）復(fù)制的起始（一）復(fù)制的起始3 5 5 3 領(lǐng)頭鏈領(lǐng)頭鏈3 5 3 5 親代親代DNA隨從鏈隨從鏈引物引物核小體核小體（二）復(fù)制的延長(zhǎng)（二）復(fù)制的延長(zhǎng) 染色體染色體DN

25、A呈線狀，復(fù)制在末端停呈線狀，復(fù)制在末端停止。止。 復(fù)制中岡崎片段的連接，復(fù)制子之復(fù)制中岡崎片段的連接，復(fù)制子之間的連接。間的連接。 染色體兩端染色體兩端DNA子鏈上最后復(fù)制的子鏈上最后復(fù)制的RNA引物，去除后留下空隙。引物，去除后留下空隙。（三）復(fù)制的終止（三）復(fù)制的終止5 3 3 5 5 3 3 5 +5 3 3 3 3 5 5 切除引物的兩種機(jī)制切除引物的兩種機(jī)制端粒端粒(telomere)(telomere) 指真核生物染色體線性指真核生物染色體線性DNA分子分子末端的結(jié)構(gòu)。末端的結(jié)構(gòu)。功能功能 維持染色體的穩(wěn)定性維持染色體的穩(wěn)定性 維持維持DNA復(fù)制的完整性復(fù)制的完整性結(jié)構(gòu)特點(diǎn)結(jié)構(gòu)特

26、點(diǎn) 由末端單鏈由末端單鏈DNA序列和蛋白質(zhì)構(gòu)成序列和蛋白質(zhì)構(gòu)成。 末端末端DNA序列是多次重復(fù)的富含序列是多次重復(fù)的富含G、C堿基的短堿基的短 序列。序列。TTTTGGGGTTTTGGGG端粒酶端粒酶(telomerase) 端粒酶端粒酶RNA (human telomerase RNA, hTR) 端粒酶協(xié)同蛋白端粒酶協(xié)同蛋白(human telomerase associated protein 1, hTP1) 端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase, hTRT) 組成組成端粒酶的催端粒酶的催化延長(zhǎng)作用化延長(zhǎng)作用爬爬行行

27、模模型型DNADNA聚合酶復(fù)制子鏈聚合酶復(fù)制子鏈進(jìn)一步加工進(jìn)一步加工逆轉(zhuǎn)錄和其他復(fù)制方式逆轉(zhuǎn)錄和其他復(fù)制方式Reverse Transcription and Other DNA Replication Ways第四節(jié)第四節(jié)逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶(reverse transcriptase) 逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄(reverse transcription) 逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄酶酶一、逆轉(zhuǎn)錄病毒和逆轉(zhuǎn)錄酶一、逆轉(zhuǎn)錄病毒和逆轉(zhuǎn)錄酶 逆轉(zhuǎn)錄病毒細(xì)胞內(nèi)的逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象逆轉(zhuǎn)錄病毒細(xì)胞內(nèi)的逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象RNA 模板模板逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶DNA-RNA 雜雜化雙鏈化雙鏈RNA酶酶單鏈單鏈DNA逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶雙鏈雙鏈DNA逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)

28、錄酶 A AA A T T T TAAAASISI核酸酶核酸酶 DNA聚合酶聚合酶堿水解堿水解 T T T T分子生物學(xué)研究可應(yīng)分子生物學(xué)研究可應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄酶，作為獲取基用逆轉(zhuǎn)錄酶，作為獲取基因工程目的基因的重要方因工程目的基因的重要方法之一，此法稱為法之一，此法稱為cDNA法。法。 以以mRNA為模板，經(jīng)為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成的與逆轉(zhuǎn)錄合成的與mRNA堿堿基序列互補(bǔ)的基序列互補(bǔ)的DNA鏈。鏈。 試管內(nèi)合成試管內(nèi)合成cDNAcDNA complementary DNA 二、逆轉(zhuǎn)錄研究的意義二、逆轉(zhuǎn)錄研究的意義 逆轉(zhuǎn)錄酶和逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象，是分子生逆轉(zhuǎn)錄酶和逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象，是分子生物學(xué)研究中的重大發(fā)現(xiàn)。物學(xué)研

29、究中的重大發(fā)現(xiàn)。 逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象說明：至少在某些生物逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象說明：至少在某些生物，RNA同樣兼有遺傳信息傳代與表同樣兼有遺傳信息傳代與表達(dá)功能。達(dá)功能。對(duì)逆轉(zhuǎn)錄病毒的研究，拓寬了對(duì)逆轉(zhuǎn)錄病毒的研究，拓寬了20世世紀(jì)初已注意到的病毒致癌理論。紀(jì)初已注意到的病毒致癌理論。 滾環(huán)復(fù)制滾環(huán)復(fù)制(rolling circle replication)三、滾環(huán)復(fù)制和三、滾環(huán)復(fù)制和D環(huán)復(fù)制環(huán)復(fù)制 是某些低等生物的復(fù)制形式，是某些低等生物的復(fù)制形式，如如 X174和和M13噬菌體等。噬菌體等。3 -OH5 -P5 5 5 3 3 3 3 5滾環(huán)復(fù)制滾環(huán)復(fù)制5 5 3 3 5 dNTPDNA-pol D環(huán)復(fù)制環(huán)復(fù)

30、制(D-loop replication) 是線粒體是線粒體DNA (mitochondrial DNA，mtDNA)的復(fù)制形式。的復(fù)制形式。 DNA損傷（突變）與修復(fù)損傷（突變）與修復(fù)DNA Damage (Mutation) and Repair第五節(jié)第五節(jié)遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)改變而引起的遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)改變而引起的遺傳信息改變，均可稱為遺傳信息改變，均可稱為突變。突變。在復(fù)制過程中發(fā)生的在復(fù)制過程中發(fā)生的DNA突變突變稱為稱為DNA損傷損傷(DNA damage)。從分子水平來看，突變就是從分子水平來看，突變就是DNA分子上堿基的改變。分子上堿基的改變。 一、突變的意義一、突變的意義（一）突變是

31、進(jìn)化、分化的分子基礎(chǔ)（一）突變是進(jìn)化、分化的分子基礎(chǔ)（二）突變導(dǎo)致基因型改變（二）突變導(dǎo)致基因型改變（三）突變導(dǎo)致死亡（三）突變導(dǎo)致死亡（四）突變是某些疾病的發(fā)病基礎(chǔ)（四）突變是某些疾病的發(fā)病基礎(chǔ)二、引發(fā)突變的因素二、引發(fā)突變的因素物理因素物理因素 紫外線紫外線(ultra violet, UV)、各種、各種輻射輻射 UV化學(xué)因素化學(xué)因素常見的化學(xué)誘變劑常見的化學(xué)誘變劑化合物類別化合物類別作作 用用 點(diǎn)點(diǎn)分子改變分子改變堿基類似物堿基類似物如：如：5-BUA 5-BU G- A - T - G - C -羥胺類（羥胺類（NH2OH）T C- T - A - C - G -亞硝酸鹽（亞硝酸鹽（N

32、O2）C U- G - C - A - T -烷化劑烷化劑如：氮芥類，如：氮芥類，NitrominsG mGG mGDNA缺失缺失G三、突變的分子改變類型三、突變的分子改變類型錯(cuò)配錯(cuò)配 (mismatch)缺失缺失 (deletion)插入插入 (insertion)重排重排 (rearrangement)框移框移(frame-shift) DNA分子上的堿基錯(cuò)配稱分子上的堿基錯(cuò)配稱點(diǎn)突變點(diǎn)突變(point mutation)。發(fā)生在同型堿基之間，即嘌發(fā)生在同型堿基之間，即嘌呤代替另一嘌呤，或嘧啶代呤代替另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。替另一嘧啶。 1. 轉(zhuǎn)換轉(zhuǎn)換發(fā)生在異型堿基之間，即嘌發(fā)生在異

33、型堿基之間，即嘌呤變嘧啶或嘧啶變嘌呤。呤變嘧啶或嘧啶變嘌呤。 2. 顛換顛換（一）錯(cuò)配（一）錯(cuò)配鐮形紅細(xì)胞貧血病人鐮形紅細(xì)胞貧血病人Hb (HbS) 亞基亞基N-val his leu thr pro val glu C 肽鏈肽鏈CAC GTG基因基因正常成人正常成人Hb (HbA)亞基亞基N-val his leu thr pro glu glu C 肽鏈肽鏈CTC GAG基因基因（二）缺失（二）缺失、插入插入和框移和框移缺失缺失：一個(gè)堿基或一段核苷酸鏈從一個(gè)堿基或一段核苷酸鏈從DNA大大分子上消失。分子上消失。插入：插入：原來沒有的一個(gè)堿基或一段核苷酸原來沒有的一個(gè)堿基或一段核苷酸鏈插入到

34、鏈插入到DNA大分子中間。大分子中間。框移突變框移突變是指三聯(lián)體密碼的閱讀方式改變是指三聯(lián)體密碼的閱讀方式改變，造成蛋白質(zhì)氨基酸排列順序發(fā)生改變。，造成蛋白質(zhì)氨基酸排列順序發(fā)生改變。 缺失或插入都可導(dǎo)致缺失或插入都可導(dǎo)致框移突變框移突變 。谷谷 酪酪 蛋蛋 絲絲5 G C A G U A C A U G U C 丙丙 纈纈 組組 纈纈正常正常5 G A G U A C A U G U C 缺失缺失C缺失引起框移突變?nèi)笔б鹂蛞仆蛔儯ㄈ┲嘏牛ㄈ┲嘏臘NA分子內(nèi)較大片段的交換，分子內(nèi)較大片段的交換，稱為重組或重排。稱為重組或重排。 由基因重排引起的兩種地中海貧血基因型由基因重排引起的兩種地中海

35、貧血基因型四、四、DNA損傷的修復(fù)損傷的修復(fù)修復(fù)修復(fù)(repairing) 是對(duì)已發(fā)生分子改變的補(bǔ)償措是對(duì)已發(fā)生分子改變的補(bǔ)償措施，使其回復(fù)為原有的天然狀態(tài)。施，使其回復(fù)為原有的天然狀態(tài)。光修復(fù)光修復(fù)(light repairing)切除修復(fù)切除修復(fù)(excision repairing)重組修復(fù)重組修復(fù)(recombination repairing)SOS修復(fù)修復(fù) 修復(fù)的主要類型修復(fù)的主要類型（一）光修復(fù)（一）光修復(fù)光修復(fù)酶光修復(fù)酶(photolyase) UVUvrAUvrBUvrCOHPDNA聚合酶聚合酶OHP （二）切除修復(fù)（二）切除修復(fù)是細(xì)胞內(nèi)最重是細(xì)胞內(nèi)最重要和有效的修復(fù)機(jī)要和有

36、效的修復(fù)機(jī)制，主要由制，主要由DNA-pol和連接酶完和連接酶完成。成。DNA連接酶連接酶ATPE.coli的切除的切除修復(fù)機(jī)制修復(fù)機(jī)制目目 錄錄切切 除除 修修 復(fù)復(fù) 動(dòng)動(dòng) 畫畫（三）重組修復(fù)（三）重組修復(fù)（四）（四）SOS修復(fù)修復(fù) 當(dāng)當(dāng)DNA損傷廣泛難以繼續(xù)復(fù)制時(shí)，由此損傷廣泛難以繼續(xù)復(fù)制時(shí)，由此而誘發(fā)出一系列復(fù)雜的反應(yīng)。而誘發(fā)出一系列復(fù)雜的反應(yīng)。 在在E. coli，各種與修復(fù)有關(guān)的基因，組，各種與修復(fù)有關(guān)的基因，組成一個(gè)稱為成一個(gè)稱為調(diào)節(jié)子調(diào)節(jié)子(regulon)的網(wǎng)絡(luò)式調(diào)的網(wǎng)絡(luò)式調(diào)控系統(tǒng)。控系統(tǒng)。 這種修復(fù)特異性低，對(duì)堿基的識(shí)別、選這種修復(fù)特異性低，對(duì)堿基的識(shí)別、選擇能力差。通過擇能力差。通過SOS修復(fù)，復(fù)制如能繼修復(fù)，復(fù)制如能繼續(xù)，細(xì)胞是可存活的。然而續(xù)，細(xì)胞是可存活的。然而DNA保留的保留的錯(cuò)誤較多，導(dǎo)致較廣泛、長(zhǎng)期的突變。錯(cuò)誤較多，導(dǎo)致較廣泛、長(zhǎng)期的突變。附附 錄錄催化催化DNA聚合聚合參與參與DNA損損傷的應(yīng)急狀傷的應(yīng)急狀態(tài)修復(fù)態(tài)修復(fù)修復(fù)合成、修復(fù)合成、切除引物、切除引物、填補(bǔ)空隙填補(bǔ)空隙功能功能2040400分子數(shù)分子數(shù)/細(xì)胞細(xì)胞1011亞基數(shù)亞基數(shù)+-+5 外切酶活性外切酶活性+ 5 外切酶活性外切酶活性+5 聚合酶活性聚合酶活性pol IIIpol IIpol IE. Coli中的中的DNA聚合酶聚合酶