《分光光度法簡(jiǎn)介》PPT課件.ppt

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第九章分光光度法簡(jiǎn)述 主講 陳友 瓊州學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 2009 11 02 第一節(jié)基礎(chǔ)知識(shí) 一 光的性質(zhì)光是一種電磁波 根據(jù)波長(zhǎng)不同 光學(xué)光譜可分為 紫光 10nm 400nm 可見光區(qū) 400nm 760nm 紅外區(qū) 760nm 300 m 白光為復(fù)合光 可分為紅 橙 黃 綠 青 藍(lán) 紫七種顏色的光 若兩種適當(dāng)顏色的單色光按一定強(qiáng)度比例混合后成為一種白光 則這兩種單色光稱為互補(bǔ)色光 二 溶液對(duì)光的選擇性吸收及溶液的呈色 當(dāng)一束白光通過某溶液時(shí) 由于溶液選擇性地吸收了可見光域中某波段的光 而使溶液呈不同顏色 與吸收光顏色互補(bǔ) 例 硫酸銅水溶液呈藍(lán)色是因?yàn)槲瞻坠庵械狞S色呈其補(bǔ)色 高錳酸鉀水溶液呈紫色是因?yàn)槲瞻坠庵械木G色呈其補(bǔ)色 溶液的顏色和吸收光顏色的關(guān)系 吸收曲線的討論 1 一種吸光物質(zhì)對(duì)不同波長(zhǎng)的光吸收程度不同 吸光度最大處對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)稱為最大吸收波長(zhǎng) max 吸收曲線是定量分析中選擇入射光波長(zhǎng)的重要依據(jù) 2 同一種物質(zhì)濃度不同 其吸收曲線形狀相似 max不變 在 max處 吸光度A正比于濃度C 測(cè)定最靈敏 3 吸收曲線可以提供物質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息 并作為物質(zhì)定性分析的依據(jù)之一 4 從吸收曲線形狀可以解釋物質(zhì)的顏色 物質(zhì)的顏色與吸收光顏色互為互補(bǔ)色 光的互補(bǔ) 藍(lán) 黃 第二節(jié)光度分析法的基本原理 一 光度分析法 在光譜分析中 依據(jù)物質(zhì)分子對(duì)光的選擇性吸收的特性而建立起來的分析方法稱為光度分析法主要有紅外吸收光譜 分子振動(dòng)光譜 吸收光波長(zhǎng)范圍800nm 50 m 主要用于有機(jī)化合物結(jié)構(gòu)鑒定 紫外吸收光譜 電子躍遷光譜 吸收光波長(zhǎng)范圍200 400nm 近紫外區(qū) 可用于結(jié)構(gòu)鑒定和定量分析 可見吸收光譜 電子躍遷光譜 吸收光波長(zhǎng)范圍400 800nm 主要用于有色物質(zhì)的定量分析 吸光光度法的特點(diǎn) 1 靈敏度高 2 準(zhǔn)確度高 3 操作簡(jiǎn)便 快速 4 應(yīng)用廣泛 二 朗伯 比耳定律朗伯 比爾定律是紫外 可見分光光度法的理論基礎(chǔ) 朗伯 比爾定律 當(dāng)一束平行單色光通過含有吸光物質(zhì)的稀溶液時(shí) 溶液的吸光度與吸光物質(zhì)濃度 液層厚度乘積成正比 即A lg bc式中 A為吸光度 摩爾吸光系數(shù) 單位L mol cm 與吸光物質(zhì)的本性 入射光波長(zhǎng)及溫度等因素有關(guān) c為吸光物質(zhì)濃度 單位mol L b為透光液層厚度 單位cm I0為入射光強(qiáng)度 I為透射光強(qiáng)度 I0 I 朗伯 比耳定律公式的物理意義 當(dāng)一束平行單色光通過均勻的有色溶液時(shí) 溶液的吸光度與溶液的濃度和液層厚度的乘積成正比 是各種有色物質(zhì)在一定波下的特征常數(shù) 它可衡量顯色反應(yīng)的靈敏度 其值越大 表示該有色物質(zhì)對(duì)此波長(zhǎng)光的吸收能力愈強(qiáng) 顯色反應(yīng)愈靈敏 例1有一5 00 g L 1Fe2 溶液 用1 10 二氮菲顯色 溶液為深紅色 用比色法測(cè)定 吸收池厚度為2cm 于波長(zhǎng)650nm處測(cè)量 得A 0 190 試計(jì)算該顯色反應(yīng)的 例2一粉紅色 Co H2O 6 2 溶液 在1 0cm吸收池中 于波長(zhǎng)530nm時(shí)測(cè)得A 0 20 已知該顯色反應(yīng)的 10L mol 1cm 1 問此配合物的濃度是多少 三 偏離Beer定律的因素 依據(jù)Beer定律 A與C關(guān)系應(yīng)為經(jīng)過原點(diǎn)的直線 偏離朗伯 比耳定律的因素 1 入射光為非單色光 3 光程的不一致性 光源不是點(diǎn)光源 比色皿光徑長(zhǎng)度不一致 光學(xué)元件的缺陷引起的多次反射等 均造成光徑不一致 從而與定律偏離 2 溶液的不均性 實(shí)際樣品的混濁 加入的保護(hù)膠體 蒸餾水中的微生物 存在散射以及共振發(fā)射等 均可吸光質(zhì)點(diǎn)的吸光特性變化大 所以 只有在一定的濃度范圍內(nèi)吸收光度才能與被測(cè)組分的濃度成正比關(guān)系 四 吸收定律的應(yīng)用 1 目視比色法用眼睛觀察來比較溶液顏色深淺以確定物質(zhì)含量的方法稱為目視比色法 2 光電比色法和光電比色計(jì) 光電比色法 用光電比色計(jì)測(cè)量一系列物質(zhì)的吸光度 從而繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 再根據(jù)被測(cè)溶液的吸光度 從標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得其濃度和含量 3 分光光度法和分光光度計(jì) 其作用原理和測(cè)量方法與光電比色法基本相同 不同的僅僅是獲得單色光的方法不同 光電比色法是通過濾光片獲得某一段波長(zhǎng)范圍的光 而分光光度法是借助棱鏡或光棚等分光器 并用狹縫分出波長(zhǎng)范圍很窄的一束近似的單色光 一 主要部件的性能與作用基本結(jié)構(gòu) 光源 單色器 吸收池 檢測(cè)器 信號(hào)顯示系統(tǒng) 樣品 紫外 可見分光光度計(jì) 在紫外可見分光光度計(jì)中 常用的光源有兩類 熱輻射光源和氣體放電光源 1光源 熱輻射光源用于可見光區(qū) 如鎢燈和鹵鎢燈 氣體放電光源用于紫外光區(qū) 如氫燈和氘燈 單色器的主要組成 入射狹縫 出射狹縫 色散元件和準(zhǔn)直鏡等部分 2單色器 單色器質(zhì)量的優(yōu)劣 主要決定于色散元件的質(zhì)量 色散元件常用棱鏡和光柵 吸收池又稱比色皿或比色杯 按材料可分為玻璃吸收池和石英吸收池 前者不能用于紫外區(qū) 3吸收池 吸收池的種類很多 其光徑可在0 1 10cm之間 其中以1cm光徑吸收池最為常用 4檢測(cè)器檢測(cè)器的作用是檢測(cè)光信號(hào) 并將光信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào) 現(xiàn)今使用的分光光度計(jì)大多采用光電管或光電倍增管作為檢測(cè)器 5信號(hào)顯示系統(tǒng)常用的信號(hào)顯示裝置有直讀檢流計(jì) 電位調(diào)節(jié)指零裝置 以及自動(dòng)記錄和數(shù)字顯示裝置等 紫外 可見吸收光譜除主要可用于物質(zhì)的定量分析外 還可以用于物質(zhì)的定性分析 純度鑒定 結(jié)構(gòu)分析 1 定性分析每一種化合物都有自己的特征光譜 測(cè)出未知物的吸收光譜 原則上可以對(duì)該未知物作出定性鑒定 但對(duì)復(fù)雜化合物的定性分析有一定的困難 紫外 可見吸收光譜的應(yīng)用 2 純度的鑒定用紫外吸收光譜確定試樣的純度是比較方便的 如蛋白質(zhì)與核酸的純度分析中 可用A280 A260的比值 鑒定其純度 3 結(jié)構(gòu)分析紫外 可見吸收光譜一般不用于化合物的結(jié)構(gòu)分析 但利用紫外吸收光譜鑒定化合物中的共軛結(jié)構(gòu)和芳環(huán)結(jié)構(gòu)還是有一定價(jià)值 例如 某化合物在近紫外區(qū)內(nèi)無吸收 說明該物質(zhì)無共軛結(jié)構(gòu)和芳香結(jié)構(gòu) 1 朗伯 比耳定律的物理意義是什么 寫出其數(shù)學(xué)表達(dá)式 思考題 答 當(dāng)一束平行的單色光通過液層厚度為b的有色溶液時(shí) 溶液的吸光度A與液層的厚度b和溶液的濃度c成正比 即A lg I0 I bc 摩爾吸光系數(shù) 的物理意義是什么 其大小與哪些因素有關(guān) 在分析化學(xué)中有何意義 答 摩爾吸光系數(shù) 在數(shù)值上等于1mol L 1吸光物質(zhì)在1cm光程中的吸光度 它是吸光物質(zhì)在特定波長(zhǎng)下的一個(gè)特征常數(shù) 其單位為L(zhǎng) mol 1 cm 1 由于 值與入射光波長(zhǎng)有關(guān) 故表示 時(shí) 應(yīng)注明所用入射光波長(zhǎng) 在分析化學(xué)中 值的大小反應(yīng)了 1 吸光物質(zhì)對(duì)某一特定波長(zhǎng)光吸光能力大小的量度 值越大 該吸光物質(zhì)的吸光能力越強(qiáng) 2 衡量光度分析方法靈敏度的重要指標(biāo) 值越大 方法的靈敏度越高 什么是吸收曲線 什么是標(biāo)準(zhǔn)曲線 它們有何實(shí)際意義 答 以入射光波長(zhǎng)作橫坐標(biāo) 用分光光度計(jì)測(cè)量每一波長(zhǎng)下物質(zhì)對(duì)光的吸光度作縱坐標(biāo)所繪制的曲線 稱為吸收曲線 其作用是 選擇入射光波長(zhǎng) 在此波長(zhǎng)下測(cè)量吸光度 則分析的靈敏度最高 因此 吸收曲線是吸光光度法中選擇測(cè)定波長(zhǎng)的重要依據(jù) 在某特定波長(zhǎng)下 用分光光度計(jì)測(cè)量一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度 然后以濃度為橫坐標(biāo) 對(duì)應(yīng)的吸光度值為縱坐標(biāo)所繪制的曲線 稱為標(biāo)準(zhǔn)曲線 亦稱工作曲線 它是作為待測(cè)物質(zhì)定量分析的依據(jù) 如果在相同條件下測(cè)得待測(cè)試液的吸光度值 從標(biāo)準(zhǔn)曲線上就可查得待測(cè)試液的濃度 這就是標(biāo)準(zhǔn)曲線法 謝謝