DZ215單片機控制半自動酶標儀

DZ215單片機控制半自動酶標儀,dz215,單片機,控制,節(jié)制,半自動,酶標儀 酶標儀簡介酶聯(lián)免疫檢測儀(ELISA Reader)是酶聯(lián)免疫吸附試驗的專用儀器.可簡單地分為半自動和全自動 2 大類,但其工作原理基本上都是一致的,其核心都是一個比色計,即用比色法來分析抗原或抗體的含量. ELISA 測定一般要求測試液的最終體積在 250 l 以下,用一般光電比色計無法完成測試,因此對酶標儀中的光電比色計有特殊要求。首先介紹一下酶標儀的工作原理及結構：酶標儀實際上就是一臺變相的專用光電比色計或分光光度計,其基本工作原理與主要結構和光電比色計基本相同. 圖示是一種單通道自動進樣的酶標儀工作原理圖. 光源燈發(fā)出的光波經(jīng)過濾光片或單色器變成一束單色光,進入塑料微孔極中的待測標本.該單色光一部分被標本吸收,另一部分則透過標本照射到光電檢測器上,光電檢測器將這一待測標本不同而強弱不同的光信號轉換成相應的電信號.電信號經(jīng)前置放大,對數(shù)放大,模數(shù)轉換等信號處理后送入微處理器進行數(shù)據(jù)處理和計算,最后由顯示器和打印機顯示結果 . 微處理機還通過控制電路控制機械驅(qū)動機構 X 方向和 Y 方向的運動來移動微孔板,從而實現(xiàn)自動進樣檢測過程.而另一些酶標儀則是采用手工移動微孔板進行檢測 ,因此省去了 X,Y 方向的機械驅(qū)動機構和控制電路 ,從而使儀器更小巧,結構也更簡單.微孔板是一種經(jīng)事先包理專用于放置待測樣本的透明塑料板,板上有多排大小均勻一致的小孔,孔內(nèi)都包埋著相應的抗原或抗體,微孔板上每個小孔可盛放零點幾毫升的溶液.其常見規(guī)格有 40 孔板,55 孔板,96 孔板等多種,不同的儀器選用不同規(guī)格的孔板,對其可進行一孔一孔地檢測或一排一排地檢測.酶標儀所用的單色光既可通過相干濾光片來獲得,也可用分光光度計相同的單色器來得到.在使用濾光片作濾波裝置時與普通比色計一樣 ,濾光片即可放在微孔板的前面,也可放在微孔板的后面,其效果是相同的. 下圖便是目前常用的酶標儀光路系統(tǒng)圖.光源燈發(fā)出的光經(jīng)聚光鏡,光欄后到達反射鏡,經(jīng)反射鏡作 90o 反射后垂直通過比色溶液,然后再經(jīng)濾光片送到光電管 .它和普通的光電比色計有以下幾點差異： (l)盛裝待測比色液的容器不再使用比色皿,而是使用塑料微孔板.微孔板常用透明的聚乙烯材料制成,對抗原抗體有較強的吸附作用,故用它作為固相載體. (2)由于盛樣本的塑料微孔板是多排多孔的,光線只能垂直穿過,因此酶標儀的光來都是垂直通過待測溶液和微孔板的,光束既可是從上到下,也可以是從下到上穿過比色液. (3)酶標儀通常不僅用 A,有時也使用光密度 OD 來表示吸光度. 酶標儀可分為單通道和多通道 2 種類型,單通道又有自動和手動 2 種之分.自動型的儀器有 X,Y 方向的機械驅(qū)動機構,可將微孔板 L 的小孔一個個依次送入光束下面測試,手動型則靠手工移動微孔板來進行測量.在單通道酶標儀的基礎上又發(fā)展了多通道酶標僅,此類酶標僅一般都是自動化型的.它沒有多個光束和多個光電檢測器,如 12 個通道的儀器設有 12 條光束或 12 個光源 ,12 個檢測器和 12 個放大器,在 X 方向的機械驅(qū)動裝置的作用下,樣品 12 個為一排被檢測.多通道酶標儀的檢測速度快,但其結構較復雜價格也較高.酶聯(lián)免疫吸附試驗方法:酶標朕免疫吸附試驗方法簡稱酶標法,是標記技術中的一種,是從熒光抗體技術,同位素免疫技術發(fā)展而來的一種敏感,特異,快速并且能自動化的現(xiàn)代技術. 酶標法的基本原理是將抗原或抗體與酶用膠聯(lián)劑結合為酶標抗原或抗體, 此酶標抗原或抗體可與固相載體上或組織內(nèi)相應抗原或抗體發(fā)生特異反應,并牢固地結合形成仍保持活性的免疫復合物.當加入相應底物時,底物被酶催化而呈現(xiàn)出相應反應顏色.顏色深淺與相應抗原或抗體含量成正比.由于此技術是建立在抗原-抗體反應和酶的高效催化作用的基礎上,因此,具有高度的靈敏性和特異性,是一種極富生命力的免疫學試驗技術.近年來，酶標儀在臨床實驗室中的應用越來越普及，使得酶免疫分析法（EIA）的自動化程度及精確性愈來愈高，尤其是近幾年，進口的、國產(chǎn)的單、多通道全自動酶標儀的種類及型號發(fā)展非常迅猛，是臨床實驗室自動化程度繼生化分析儀、血細胞計數(shù)儀、血凝儀等之后的又一次更新和提高。然而，國內(nèi)外有關酶標儀性能系統(tǒng)評價的方法甚少，有的評價指標簡單且不全面，有的對其性能評價所采用的方法不盡一致，導致不同儀器之間、廠家與用戶之間、用戶與用戶之間的評價指標缺乏可比性，這是由于酶標儀在制造工藝（多通道檢測器） 、測定原理（垂直光路光度測定法）與其它水平光路光度測定的儀器（721 分光光度計）之間存在著很大的差別。因此，我們對國內(nèi)外幾個不同廠家和型號的儀器經(jīng)過系統(tǒng)研究論證，初步建立了一套較為完善的酶標儀性能評價指標與鑒定的基本方法。經(jīng)初步應用，效果滿意，應廣大讀者和用戶的要求，擬將酶標儀性能評價與鑒定方法的理論及其原理作一介紹和補充，以供同行在評價、鑒定和使用儀器時參考，從而為進一步提高檢測結果的室內(nèi)重復性和室間可比性提供可靠的保證。濾光片波長精度檢查及其峰值測定:方法及其衡量的標準：用高精度紫外可見分光光度計（波長精度±0.3 nm）對不同波長的濾光片進行光譜掃描，檢測值與標定值之差即為濾光片波長精度，其差值越接近于零且峰值越大表示濾光片的質(zhì)量越好，波長精度越高。理論基礎：酶標儀的濾光片質(zhì)量好壞，直接影響儀器的靈敏度高低，而濾光片的質(zhì)量又是以其波長精度及其峰值指標來衡量的，因此濾光片波長精度及峰值是衡量酶標儀的重要參數(shù)之一，這在廠家的儀器說明書中雖未曾提及，但在儀器的實際使用過程中，我們發(fā)現(xiàn)對濾光片波長精度和峰值進行檢查是重要的也是必要的，通過檢查可以發(fā)現(xiàn)濾光片的波長標定值與實測值的符合程度，可以發(fā)現(xiàn)濾光片的質(zhì)量是否符合要求。靈敏度和準確度的監(jiān)測:①靈敏度：精確配制 6 ug/ml 重鉻酸鉀（干燥）溶液（0.05 mo1／L 硫酸溶解） ，加入 200 ul 重鉻酸鉀溶液于小孔杯中，以 0.05 mo1／L 硫酸溶液作空白，于 450 nm（參比波長 650 nm）測定，其吸光度應≥ 0.01 A。②準確度：準確配制：1mmo/L 對硝基苯酚（提純品）水溶液，然后以 10 mmo1／L 氫氧化鈉溶液 25 倍稀釋之，加入 200 ul 稀釋液于小孔杯中，以 10 mmo1／L NaOH 溶液作空白，于 405 nm（參比波長 650 nm）檢測，其吸光度應在 0.4 A（0.395～0.408 A）左右。說明：儀器的靈敏度和準確度主要受兩個因素影響：一是濾光片波長的精度，二是檢測器的質(zhì)量。通常情況下，濾光片原因?qū)е聝x器的靈敏度和準確度下降比較容易檢查；而檢測器質(zhì)量差異則不易被發(fā)現(xiàn)，因此我們采用上述兩種標準物質(zhì)溶液對儀器檢測器的質(zhì)量進行定期監(jiān)測，從而保證了儀器檢測結果的可靠性。對于儀器準確性的測定，我們采用了文獻報道的方法，經(jīng)過多次在不同型號儀器間進行反復測定，結果發(fā)現(xiàn)該標準物溶液在 450nm 波長處有一較為恒定的測定值，由于酶標儀與其它分光光度計的光學原理不完全相同，故是否可以作為評價酶標儀準確性的參考方法還有待同行進一步研究考證。通道差與孔間差檢測:方法及其表達方式：①通道差檢測：取一只酶標板小孔杯（杯底須光滑、透明、無劃痕、無污染）以酶標板架作載體，分別加入三種不同濃度的甲基橙溶液 200 ul 先后置于 8 個通道的相應位置，蒸餾水調(diào)零，采用雙波長（測定波長 490nm，參比波長 630 或 650nm，以下均相同）連續(xù)測三次，觀察其不同通道之間測量結果的一致性可用極差值來表示其通道差。②孔間差的測量：選擇同一廠家、同一批號酶標板條（8 條共 96 孔）分別加入 200 ul 甲基橙溶液（吸光度調(diào)至 0.065～ 0.070 A）先后置于同一通道，蒸餾水調(diào)零，采用雙波長檢測，其誤差大小用±1.96s 衡量。理論解釋：為了提高酶標儀的檢測速度，根據(jù) 96 孔酶標板的規(guī)格特點，目前大多數(shù)廠家的中、高檔酶標儀均采用 8 通道的檢測器（部分中、低檔酶標儀目前仍采用單通道） ．因而它們每個通道的檢測能力是不盡相同的，它是儀器內(nèi)部的固有誤差，與所測溶液濃度成正相關（不同檢測器對不同濃度溶液的響應能力不同） ，所以通道差是衡量酶標儀性能良好與否的重要指標之一；其衡量指標用極差表示，這與廠家推薦的指標是一致的；極差值越接近于零，通道差越小，說明同一樣品于不同通道檢測結果的一致性越好。由于不同廠家、不同批號酶標板之間的質(zhì)量差異，導致孔與孔之間的檢測結果也不完全一致，這與水平光路光度計的比色皿質(zhì)量是否符合要求一樣，因此我們認為孔間差是儀器外部的固有誤差，只有準確測知孔間差，并對結果作出相應的校正，才能使檢驗結果更符合實際情況、更準確可靠；采用的評價指標（士 1.96 s）也是有利于結果校正的。另外，在設計孔間差測量的操作方法上，我們將 200 ul 甲基橙溶液吸光度調(diào)至 0.065～0.070 A，是充分考慮到加樣器的誤差（上海求精公司，200 ul，士 2％CV） ，其目的是使加樣誤差控制在儀器的分辨率（0.01 A）以下，這樣也就避免了孔間差結果不因加樣誤差而導致假性增高零點飄移:方法：取八只小孔杯，分別置于八個通道的相應位置，均加入 200 ul 蒸餾水并調(diào)零，采用雙波長或單波長（490 nm）每隔 30 min 測定一次，觀察 8 個通道 4h 內(nèi)的吸光度變化。其與零點的差值即為零點飄移。測量原理：酶標儀的零點飄移通常是很小的，這是由于儀器在讀數(shù)之前，先要做 8 個通道的本底測量（Io ） ．然后再讀取樣品板的各孔測定值（I ） ，根據(jù) Beer‘s law 光吸收值 =1ogl0（Io ／I） ，每次讀數(shù)經(jīng)過如此的自動校正，使得讀數(shù)誤差大大降低，這樣的測讀方式無疑是非常正確的的；另外有的儀器是應用"DRL DYE"檢測試條來進行絕對吸光度的校準的，因此在采用單波長測量時，會導致吸光度的假性增高，這種儀器可采取兩種方法進行校正，一是選擇一合適的參比濾光片進行雙波長測定，二是引入修正參數(shù)，即在吸光度模式下單波長讀取 1 個空白孔，其測試值和預測值之差值即為修正參數(shù)。所以零點飄移是評價儀器在一定時間內(nèi)零點吸光度的變化趨勢，與波長無關，它間接地反映了儀器內(nèi)部檢測系統(tǒng)在單位時間內(nèi)處于工作狀態(tài)下的穩(wěn)定性及儀器的機械性能情況（連續(xù)進板、檢測、退出） ，故它是評估儀器內(nèi)部電路系統(tǒng)、光學系統(tǒng)（檢測器）及機械系統(tǒng)良好與否的指標。精密度評價方法及評價指標：每個通道三只小杯，分別加入 200 ul 高、中、低三種不同濃度的甲基橙溶液，蒸餾水調(diào)零，采用雙波長作雙份平行測定，每日測定兩次，連續(xù)測定 20 天。分別計算其批內(nèi)精密度、日內(nèi)批間精密度、日間精密度和總精密度及相應的 CV 值。理論依據(jù)：1984 年美國臨床實驗室標準委員會發(fā)表了 EP5 一 T 文件并于1992 年進行了第二次修訂：臨床化學儀器精密度性能的用戶評價。該評價方案在生化分析儀、血細胞計數(shù)儀等儀器和試劑的評價中得到了廣泛的應用，使評價儀器的方法得到了統(tǒng)一；而該法應用于酶標儀的評價在國內(nèi)外則尚未見有類似的報道，我們采用該法對酶標儀進行系統(tǒng)評價，結果是比較滿意的。各指標的意義為：批內(nèi)精密度系由 20d 中每天兩批，每批兩次之差（即"批內(nèi)" ）經(jīng)統(tǒng)計學處理后所得的結果；日內(nèi)批間精密度系由 20d 中每天兩批測定結果均值之差（即" 批間 "）經(jīng)統(tǒng)計學處理后所得的結果；日間精密度表示 20 d 中每天所測均值的標準差即標準誤，反映了每日均值的離散度；總精密度則是對批內(nèi)、批間和日間精密度進行加權統(tǒng)計的結果。其中以批內(nèi)精密度和總精密度的應用最為廣泛，與傳統(tǒng)的批內(nèi)精密度的計算方法（即對同一標本在同一天內(nèi)同時重復測定多次）相比，前者更符合實驗室的實際情況，更有代表性，也更加合理；而總精密度則客觀地全面地反映了實驗室的總體變異情況。線性測定:方法：精確稱取甲基橙配制 5 個系列濃度的溶液，采用雙波長平行檢測 8次求其均值。計算回歸方程、相關系數(shù) r 及標準估計誤差 Sy,x，并用±1.96 Sy,x 表示樣品的 95％測量范圍。評價指標解釋：線性測定也是評價儀器的重要手段之一，因為它是儀器開展定量工作的基礎和前提，某些廠家用標準估計誤差 s 來衡量線性，這與實驗室通常所采用的相關系數(shù) r 是一致的，因此在進行線性評估時，我們同時報告 r 和 Sy,x，目的是為了增強用戶與廠家之間的可比性。雙波長評價方法：在運用酶標儀檢測樣品時，由于溶液中的小氣泡、杯底的水紋印及劃痕、小孔杯之間透明度的差異等等，這些都是儀器測定過程中最常見的干擾因素，而標本中的干擾組份（如溶血、黃道）因洗滌而對測定結果影響則較小，因此我們將文獻中的雙被長評價方法改為：取同一廠、同一批號酶標板條（每個通道 2 條共 24 孔）每孔加入 200 ul 甲基橙溶液（吸光度調(diào)至 0.065～0.070 A）先后于 8 個通道分別采用單波長（ 490 nm）和雙波長（測定波長 490 nm、參比波長 630／ 650 nm）進行檢測，計算單波長和雙波長測定結果的均值、離散度，比較各組之間是否具有統(tǒng)計學差異以考察雙波長清除干擾因素的效果。說明：雙波長測定過程中，由于標本中干擾組份的存在以及小孔杯本身質(zhì)量等原因，常常導致測定結果的假性增高，而酶標儀提供的雙波長測定功能則可以消除干擾組份或因素對測定結果的影響．對于標本中干擾組份的清除，在選擇參比波長時，我們應對于擾組份的光譜進行研究，以正確選擇參比波長；而對于小孔杯本身質(zhì)量問題等干擾因素的消除，只要選擇遠離測定波長的參比波長即可以了、這對保證測定結果的準確性是非常重要的。小結:目前，國內(nèi)外有關酶標儀性能評價與鑒定方法的報道尚不多見，由于酶標儀在臨床實驗室中的應用越來越普及，因而，建立一套完善的酶標儀性能評價方法并對儀器進行全面的較為系統(tǒng)的綜合評價乃是臨床實驗室工作人員的當務之急，這對進一步增強儀器之間的可比性和保證 ELA 法的工作質(zhì)量是至關重要的，同時將其評價指標引入到檢測結果的校正工作中，合理地作出各個定性試驗項目的可信限與界值，對正確判讀結果和開展定量檢測工作具有一定的指導意義。在對酶標儀進行評估時，還應對儀器的自動化程度及售后服務有一個比較全面的了解。自動化程度如儀器的分辨率（一般為 0.001 A） 、報告的方式（通常提供 4～6 種以上的格式） 、可提供濾光片的最大數(shù)目（有些廠家可根據(jù)用戶要求訂做） 、是否提供用戶自編程序及外接微機的功能和軟件等等。售后服務也是儀器使用順利與否的根本保證，用戶應當與信譽較好、服務周到、維修方便的代理商進行恰談，以免儀器一旦出現(xiàn)故障，而不致于影響工作或使儀器處于癱瘓狀態(tài)不能發(fā)揮應有的社會效益和經(jīng)濟效益。另外需要強調(diào)的是：由于酶標儀的種類、型號繁多，每個儀器的測量原理也不盡相同，為了保證不同儀器之間測定結果的一致性，我們認為在測定時應采用雙波長法，而且必須采用雙波長，這樣既能消除干擾組份和干擾因素的影響，又能避免因儀器測量原理不同而造成儀器之間結果的不一一致性。摘自《陜西醫(yī)學檢驗》1998.13(4)12