【基金標書】2010CB945400-干細胞向生殖細胞誘導分化的調(diào)控機理及應用性研究

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項目名稱： 干細胞向生殖細胞誘導分化的調(diào)控機理及應用性研究首席科學家： 松陽洲 中山大學起止年限： 2010年 1月-2014 年 8月依托部門： 教育部一、研究內(nèi)容本項目將以胚胎干細胞及誘導多能干細胞（iPS）為技術平臺，研究哺乳動物干細胞向生殖細胞分化以及生殖細胞減數(shù)分裂的調(diào)控網(wǎng)絡和機理，并建立研究生殖細胞分化所需的生物技術平臺及多種細胞及小鼠模型，從而提高干細胞向生殖細胞誘導分化的效率，為大型 經(jīng)濟動物優(yōu)質(zhì)培育奠定基礎。（1）利用蛋白質(zhì)組學，BiFC 組學, 信息學研究平臺，建立以 PGC 關鍵調(diào)控元為中心的信號調(diào)控網(wǎng)絡，篩選控制 PGC 基因表達的關鍵因子，并 闡述端粒蛋白以及端粒酶在干細胞向 PGC 誘導分化過程中的作用機理。同時利用表觀遺傳學研究技術，分析 PGC 誘導過程中組蛋白修飾的動態(tài)過程和不同修飾與 PGC 發(fā)育之間的相互關系。探討以上關鍵信號調(diào)控網(wǎng)絡、關 鍵因子在誘導牛干細胞向生殖細胞分化過程中的調(diào)控機理。 (2) 利用基因組學、蛋白質(zhì)組學研究技術，系 統(tǒng)地分析精原干細胞和胚胎干細胞的特異性差異。闡明雄性生殖細胞中誘導減數(shù)分裂的分子機制，建立干細胞體外誘導分化雄性生殖細胞的理論體系，并分析體外生成生殖細胞的生物學功能。(3)以人及小鼠胚胎干細胞體外分化系統(tǒng)為模型，優(yōu)化 PGC 特化的條件，并通過轉(zhuǎn)基因及基因敲除的方法，探索關鍵轉(zhuǎn)錄因子及信號網(wǎng)絡在 PGC 形成過程中的功能及調(diào)控機理。(4)建立較為完善的牛 ES 細胞體外培養(yǎng)體系，探討牛干細胞自我更新和分化途徑。通過轉(zhuǎn)基因技術、選擇合適的生長因子、 轉(zhuǎn)錄因子和培養(yǎng)體系誘導牛 ES 細胞分化為雄性生殖細胞，并建立相應的技術平臺。二、預期目標總體目標本項目以研究誘導分化技術、蛋白調(diào)控網(wǎng)絡、減數(shù)分裂機理及農(nóng)業(yè)經(jīng)濟動物培育為主線，緊密圍繞以上 3 個擬解決的關鍵科學問題。在建立的多種技術平臺的基礎上， 確立以 PGC 關鍵調(diào)控元為中心的信號調(diào) 控網(wǎng)絡， 篩選控制 PGC 基因表達的關鍵因子。系統(tǒng)地分析精原干細胞與胚胎干細胞之間特異性差異，闡明雄性生殖細胞中誘導減數(shù)分裂的分子機制。同時，建立體外誘導培養(yǎng)功能性生殖細胞的技術體系，以小鼠為主要研究對象， 嘗試應用干 細胞誘導產(chǎn)生的生殖細胞來培育優(yōu)化動物，最終確立我國在這一極富競爭性的前沿探索領域的領先地位。五年預期目標1，發(fā)展基于干細胞學和生殖細胞學研究的一整套方法和綜合技術平臺。2，建立以 PGC 關鍵調(diào)控元為中心的較為完整的信號調(diào)控網(wǎng)絡， 篩選出控制 PGC基因表達的幾個關鍵因子。3，明確端粒蛋白以及端粒酶在干細胞向 PGC 誘導過程中的作用機理，并揭示 組蛋白修飾的動態(tài)過程和不同修飾與 PGC 發(fā)育之間的相互關系。4，明確精原干細胞和胚胎干細胞之間的基因表達差異，確定 3-6 個差異表達基因。5，闡明雄性生殖細胞中誘導減數(shù)分裂的分子機制。6，建立一整套誘導 PGC 生成的培養(yǎng)體系。7，建立 1-3 個體外培養(yǎng)生長狀況良好、表達干 細胞 標記的牛 ES 細胞系，初步 闡明牛干細胞自我更新和分化的可能途徑。8，力爭建立牛 ES 細胞體外 誘導分化形成功能性配子（精子、卵子）的技 術體系。9，在國際重要學術刊物上發(fā)表高水平論文 40 篇以上。其中影響因子大于 10 的論文 8 篇以上。10，培養(yǎng)一批從事干細胞研究的交叉學科人才。11，主辦一次生殖細胞學研究的國際性學術研討會。12，申請發(fā)明專利 10 項以上。三、研究方案1，總體思路干細胞具有自我更新、高度增殖和多向分化的潛能。 干細胞的功能則是通過細胞內(nèi)外因子對蛋白質(zhì)組和基因組的動態(tài)調(diào)控來實現(xiàn)的。 因此探討干細胞生長微環(huán)境、蛋白質(zhì)間 相互作用、 組蛋白修飾與基因表達之間的相互關系，并依此建立干細胞向生殖 細胞分化的調(diào)控蛋白質(zhì)網(wǎng)絡和定向誘導技術體系將是本項目的重要研究方向。2，技術途徑根據(jù)以上的學術思路，本項目的總體研究技術途徑如圖2所示。具體地，本項目將首先建立能夠系統(tǒng)挖掘生殖細胞靶蛋白及其體外誘導分化的技術手段與平臺，包括：蛋白質(zhì)組 學平臺、蛋白 質(zhì)BiFC 表達 庫和RNAi 庫、生物信息學技術平臺和動物模型技術平臺。通過這些平臺，系 統(tǒng) 地發(fā)現(xiàn)與生殖細胞分化相關的調(diào)控網(wǎng)絡，并進一步利用現(xiàn)代分子生物學、 細 胞培養(yǎng)等技術確定一些蛋白質(zhì)的靶蛋白網(wǎng)絡和功能以及調(diào)控機理。在這些基礎研究的基礎上，進一步以小鼠和農(nóng)業(yè)經(jīng)濟動物為研究對象，應用干細胞誘導產(chǎn)生的生殖細胞來培育優(yōu)化動物。 3，可行性分析本項目的總體方案是切實可行的。首先，本 項目提出的主要科學問題和研究目標不僅具有理論和實際依據(jù)，而且都是該領域前沿性和關鍵性的問題。我們在干細胞學、胚胎發(fā)育學、生殖學等領域進行了多年的研究，取得了一些重要的成果，具備 完成本項目的堅實 基礎。研究方案建立在申請者以及項目組成員大量的相關研究工作的基礎上，實驗設計合理周密。研究 課題 所用的方法和材料都是本項目組成員多年應用、被證 明是行之有效的方法；而且，我們的課題組成員積累了大量的關鍵性研究材料，如各種ES 細胞系，iPS細胞，轉(zhuǎn)基因鼠，牛等，可為本項目的實施提供強有力的保證。其次， 項目承擔單位具有良好的研究條件和基礎，并且已經(jīng)具備了相當?shù)囊?guī)模、取得了很好的科研成果。我們擁有完善的蛋白質(zhì)組學，BiFC，基因組學，信息學，干細胞學等研究平臺，可以完成本項目所涉及的研究工作。中山大學及其他參與的單位擁有大型及關鍵性儀器設備，采用公共平臺建設方式，已擁有的條件（ 動物房和儀器設備等）、各重點學科實驗室等設備均可公用，這將為本項目提供較全面的技術條件。本 項目注重各研究課題之間的配合、確保信息共享，發(fā)揮專業(yè)交叉、知識互補、團結協(xié)作的精神，確保本項目圓滿、順利完成。其三，承擔本項目研究工作的中堅力量和學術骨干多數(shù)是新近從海外留學工作歸國的成績卓著的中青年科學家，擁有豐富的研究成果和研究經(jīng)驗，多次在國際著名專業(yè)雜志上發(fā)表論文。這些都是確保研究項目順利實施和取得重大成果的最基本、最關鍵的因素。本項目課題組成員熟悉當前的研究狀況和方法，對本項目的研究具有較強的掌控能力和應變能力，能夠保證項目的順利完成。4，創(chuàng)新點本項目探討影響國計民生的的重大科學問題。項目中的四個子課題既相互獨立，又交叉互補。這些課題既是有關研究人員各自多年工作的合理延伸和拓展，又集中了優(yōu)勢力量，對誘導 干細胞向生殖細胞分化中的核心問題進行多側(cè)面的合作研究。本題目的創(chuàng)新性主要體現(xiàn)在：(1)本項目探討 的問題是國際前沿的科學問題，因此保證了項目的創(chuàng)新性。本項目的選題涉及干細胞向生殖細胞分化過程中重要蛋白調(diào)控網(wǎng)絡；雄性生殖細胞體外誘導分化的基因表達及調(diào)控機理；胚胎干細胞向原始生殖細胞分化的體系及機理；干細胞向生殖細胞誘導分化技術在農(nóng)業(yè)經(jīng)濟動物培育上的應用等科學問題。將基礎科學與實際應用相結合，力爭在解答基礎科學問題的同時，發(fā)展新的動物繁殖技能。(2)本項目在充分利用 課題組已建立的蛋白質(zhì)組學研究平臺，BiFC研究平臺（松陽洲教授研究團隊獨創(chuàng)），信息學研究平臺和基因組學研究平臺的基礎上，發(fā)展和創(chuàng)建綜合技術平臺及多種細胞和動物模型，分析從干細胞誘導生成生殖細胞過程中的蛋白調(diào)控網(wǎng)絡和基因調(diào)控機理，填補生殖細胞發(fā)育機理和干細胞分化機制研究領域的空白，為干細胞的再生醫(yī)學及畜牧產(chǎn)業(yè)的應用提供新的途徑。(3)本項目著眼于 技術創(chuàng)新, 通過建立誘導干細胞生成生殖細胞的技術體系，獲得功能性生殖細胞，為大型經(jīng)濟動物優(yōu)良種群的培育提供技術支持。同時，通 過建立大型經(jīng)濟動物胚胎干細胞，研究在體外特定條件下的分化潛能，嘗試培育生長性能好、環(huán)境友好型、品質(zhì)優(yōu)良的新品種。 這些可為 人類提供高品質(zhì)食源，具有非常明顯的創(chuàng)新性。通過這些嘗試，可能開辟家畜育種和保種的新途徑、新方法，也可以促進干細胞在人類醫(yī)療事業(yè)上的早日應用。5，組織方式(1)在組織方面，以總體研究方案為中心，強調(diào)團隊化、體系化。瞄準 戰(zhàn)略目標，統(tǒng)一思路，力求持續(xù)發(fā)展。項目規(guī)劃管理和運作體制包括總項目和子課題兩個層次。項目設負責人 1 名（首席科學家），負責整個項目的 貫通實施。首席科學家聘任若干學術專家組成項目顧問專家組，參與項目的領導、組織、運行和管理， 協(xié)助項目負責人，調(diào)整和確定項目的方向及技術路線，制定有效可行的研究計劃，指 導協(xié)調(diào)各課題的工作，督促各課題間的交流，并 審核各子課題的進展情況。 顧問專家由相關學科領域成就卓著的專家組成，承擔單位之外的專家占絕大多數(shù)。(2) 在研究方面，不只停留在單項技術或研究手段上，而是發(fā)展綜合技術平臺及多種細胞和動物模型。為此，本項目將以系統(tǒng)性運作方式為主。不但充分 發(fā)揮子課題各承擔單位的技術和學科優(yōu)勢，而且加強優(yōu)勢力量的整合和協(xié)同攻關，發(fā)揚團隊精神，形成科研功能配套、統(tǒng)籌合理、機 動靈活且充 滿活力的科研體系。6，課題間的相互關系本項目以中山大學為主體，聯(lián)合中國科學學院， 華東師范大學及中國農(nóng)業(yè)大學等單位， 圍繞總體研究目 標，本 項目設立4個課題組 ，研究 過程中相互配合、優(yōu)勢互補，提倡資源共享。本項目的執(zhí)行采用首席科學家 負責制。首席科學家將充分發(fā)揮課題負責人和學術帶頭人的作用，采用學科交叉、分工合作的方式來實施研究計劃。同時，首席科學家將在相關部門的領導下，根據(jù)國家規(guī)定，通過項目專家委員會，采用激勵和滾動機制對項目進行管理。本課題設置上緊密圍繞干細胞誘導生成生殖細胞這一重大科學問題，以研究誘導分化技術、蛋白調(diào)控網(wǎng)絡、減數(shù)分裂機理以及農(nóng)業(yè)經(jīng)濟動物培育為主線，將各個課題有機地結合起來，使各方面的研究工作既具有明確的研究目標，同時又相互緊密聯(lián)系，形成我國在這一前沿領域的研究特色。本項目期望在誘導干細胞生成生殖細胞關鍵科學問題上取得重大突破性成果，保證按期完成項目的總體目標和五年目標。課題 2. 雄性生殖細胞體外誘導分化的基因表達及調(diào)控機理研究課題 1. 干細胞向生殖細胞分化過程中重要蛋白調(diào)控網(wǎng)絡的解析干細胞向生殖細胞誘導分化的調(diào)控機理及應用性研究闡明干細胞向生殖細胞分化機理產(chǎn)生功能性配子與克隆動物建立以PGC 關鍵調(diào)控元為中心的信號調(diào)控網(wǎng)絡全面了解轉(zhuǎn)錄因子和組蛋白修飾在PGC 形成中的功能與調(diào)控機制闡述端粒蛋白以及端粒酶在干細胞向 PGC誘導過程中的作用與機 理探索誘導分化的生殖細胞的生物學功能及其對小鼠胚胎發(fā)育的影響比較ESC和 SSC DNA甲基化模式、基因表達和細胞表面蛋白成分的差 異檢索RA 信號調(diào)控的靶基因,分析減數(shù)分裂的機 理探討在誘導牛干細胞向生殖細胞分化過程中信號調(diào)控網(wǎng)絡課題 3. 誘導胚胎干細胞向原始生殖細胞分化的體系及機理研究優(yōu)化促進 PGC形成的最佳體外培養(yǎng)條 件探討關鍵基因在小鼠PGC 特化過程中的功能及體內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式創(chuàng)建表達標志PGC 特化的報告基因體 系，探討關鍵信號網(wǎng)絡的調(diào)控機 理課題 4. 干 細 胞向生殖 細 胞 誘導 分化技術 在 農(nóng)業(yè)經(jīng)濟動 物培育上的 應 用建立合適的牛ESC 體外培養(yǎng)體系利用創(chuàng)建的牛ESC 體系，探討牛干細胞自我更新和分化的途徑誘導牛ESC 分化為雄性生殖細胞建立以ESC 體外誘導分化為功能性生殖細胞的技術平臺課題1，干細胞向生殖細胞分化過程中重要蛋白調(diào)控網(wǎng)絡的解析研究目標：建立和完善高通量研究蛋白互動網(wǎng)絡以及干細胞向生殖細胞分化的技術平臺，包括蛋白質(zhì)組學平臺，BiFC 組學平臺, 基因組學平臺，生物信息學平臺。在此基礎上，發(fā)現(xiàn)若干新的調(diào)控干細胞向生殖細胞分化的關鍵轉(zhuǎn)錄因子和染色質(zhì)修飾因子，在整體細胞水平上初步確立干細胞向生殖細胞分化的網(wǎng)絡系統(tǒng)。研究內(nèi)容：1, 以一些 PGC 表達的關鍵調(diào)控元，如 Nanog, Oct4，RAR/RXR, Smad 為研究對象, 運用蛋白質(zhì)組學及 BiFC 組學平臺, 系統(tǒng)地發(fā)現(xiàn)直接與關鍵調(diào)控元相互作用的蛋白, 并依此建立以 PGC 關鍵調(diào)控元為中心的信號調(diào)控網(wǎng)絡。2, 以 Blimp1 、Stella, PITX2, c-kit、Stra-8, vasa 和 DAZL 等重要的 PGC 表達基因為模式， 從 PGC 或生殖母細胞調(diào)控元及與其相互作用的蛋白質(zhì)組中篩選出控制這些基因表達的關鍵因子。從表觀遺傳學著手，研究 PGC 誘導過程中組蛋白修飾的動態(tài)過程和不同修飾與 PGC 或精子發(fā)育之間的相互關系，以全面了解轉(zhuǎn)錄因子和組蛋白修飾（著重于組蛋白酰基化、甲基化的研究）在 PGC 形成中的功能與調(diào)控機制。3, 利用四環(huán)素調(diào)節(jié)表達系統(tǒng), RNAi, ChIP 等技術闡述端粒蛋白以及端粒酶在干細胞向 PGC 誘導過程中的作用與機理。4, 探討在誘導牛干細胞向生殖細胞分化過程中，以上信號調(diào)控網(wǎng)絡的適用性。課題承擔單位： 中山大學 課題負責人： 松陽洲 教授 （中山大學）主要學術骨干： 張 雁 教授 （中山大學）項 鵬 教授 （中山大學）周天壽 教授 （中山大學）張勤奮 副教授 （中山大學）王繼剛 講師 （華東師范大學）李鯤鵬 講師 （中山大學）課題經(jīng)費比例： 占申請經(jīng)費的31%課題 2，雄性生殖細胞體外誘導分化的基因表達及調(diào)控機理研究研究目標：通過對精原干細胞和胚胎干細胞的表觀遺傳，基因表達和表面蛋白差異的系統(tǒng)分析，對視黃素(RA)信號通路及其在精子生成 細胞中誘導減數(shù)分裂功能的特異性分析，闡述精原干細胞分化的調(diào)控機制，為干細胞體外誘導分化雄性生殖細胞提供依據(jù)。研究內(nèi)容：1，利用測序的方法（如 CpG 二核苷酸位點上的甲基化）， cDNA 基因芯片的篩選，蛋白質(zhì)組學和質(zhì)譜分析技術，系統(tǒng)地比較胚胎干細胞和精原干細胞 DNA 甲基化模式、基因表達和細胞表面蛋白成分的差異。2，通過生物信息學技術，利用 RAR/RXR 在 DNA 結合區(qū)域的序列保守性，檢索精子前體細胞中 RA 信號調(diào)控的靶基因。分析核受體 RAR/RXR 復合體在精原細胞中的特異性及其調(diào)節(jié)減數(shù)分裂的機理。3．利用全細胞成像及分子生物學技術分析誘導分化的雄性生殖細胞，通過小鼠曲細精管內(nèi)細胞注射和卵細胞胞漿內(nèi)精子注射，探索體外誘導分化的生殖細胞的生物學功能及其對小鼠胚胎發(fā)育的影響。課題承擔單位：中國科學院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院課題負責人： 楊東山 副研究員（中國科學院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院）主要學術骨干：戚華宇 研究員 （中國科學院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院）謝 亭 教授 （中國科學院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院）徐仁和 教授 （中國科學院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院）課題經(jīng)費比例：占申請經(jīng)費的23%。課題3， 誘導胚胎干細胞向原始生殖細胞分化的體系及機理研究研究目標：本課題將完善胚胎干細胞分化為 PGC 的技術體系，建立 PGC 特化過程中關鍵因子的轉(zhuǎn)基因及基因敲除的胚胎干細胞株及小鼠模型，揭示關鍵轉(zhuǎn)錄因子及信號網(wǎng)絡在 PGC 形成過程中的功能及調(diào)控機理。研究內(nèi)容1， 使用我們現(xiàn)有的 Oct4-GFP 及 Stella-GFP 胚胎干細胞株, 結合其它 PGC 特異性分子標記，利用無血清培養(yǎng)方式, 優(yōu)化促進 PGC 形成的最佳體外條件；并以gonadal 細胞共培養(yǎng)的方式建立適合 PGC 生長的微 環(huán)境。2， 利用轉(zhuǎn)基因及基因敲除技術，建立特定基因過量表達或缺失的胚胎干細胞株及小鼠模型，探討關鍵基因（如激素受體及 BMP 家族）在小鼠 PGC 特化過程中的功能及體內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式。 3，在人胚胎干細胞中創(chuàng)建穩(wěn)定表達標志 PGC 特化的報告基因體系 (Blimp1-GFP 和 Stella-GFP 等)，以有效地 監(jiān)測 PGC 的形成，并利用此體系，優(yōu)化從人胚胎干細胞誘導分化 PGC 的條件，探 討關鍵轉(zhuǎn)錄因子及信號網(wǎng)絡的調(diào)控機理。課題承擔單位： 華東師范大學課題負責人： 王 媛 特聘教授 （華東師范大學）主要學術骨干： 李大力 副研究員 （華東師范大學）周文良 教授 （中山大學）葉希韻 副教授 （華東師范大學）課題經(jīng)費比例： 占申請經(jīng)費的23%。課題 4，干 細 胞向生殖 細 胞 誘導 分化技 術 在 農(nóng)業(yè)經(jīng)濟動 物培育上的 應 用研究目 標 ：建立牛 ES 細胞的體外培養(yǎng)體系和體外定向 誘導分化技術平臺，從而揭示牛多能干細胞體外分化與發(fā)育的潛能,獲得具有生物活性的配子（精子、卵子），利用這些技術加速優(yōu)良經(jīng)濟動物種群的培育。研究內(nèi)容：1，參照人和動物 ES 細胞建系的技 術，選用不同胚 齡及各種附植前牛胚胎的內(nèi)細胞團，建立合適的牛 ES 細 胞體外培養(yǎng)體系。4，以其它子課題的蛋白網(wǎng)絡調(diào)控等相關研究為基礎，利用創(chuàng)建的牛 ES 細胞體系，探討牛干細胞自我更新和分化的途徑。5，通過轉(zhuǎn)基因技術、選擇合適的生長因子、 轉(zhuǎn)錄因子和培養(yǎng)體系誘導牛 ES 細胞分化為雄性生殖細胞，為經(jīng)濟動物的改良服務。6，以牛 ES 細胞誘導分化而來的精子為核供體，分析胞質(zhì)內(nèi)注射后胚胎的發(fā)育能力，建立以 ES 細胞體外 誘導分化為功能性生殖細 胞的技術平臺。課題承擔單位： 中國農(nóng)業(yè)大學課題負責人： 朱 捷 教授 （中國農(nóng)業(yè)大學）主要學術骨干： 陳瑤生 教授 （中山大學）周光斌 副教授 （中國農(nóng)業(yè)大學）于政權 副教授 （中國農(nóng)業(yè)大學）課題經(jīng)費比例 占申請經(jīng)費的23%四、年度計劃第一年：1, 建立較為理想的從小鼠胚胎干細胞誘導 PGC 形成的培養(yǎng)體系。2，檢測不同生長因子的誘導作用,并嘗試體外誘導 PGC 減數(shù)分裂形成功能性配子。3，利用蛋白質(zhì)組學及 BiFC 組學研究技術, 系統(tǒng)地從 human ORFeome (12000 個基因) 或其他逆 轉(zhuǎn)錄病毒表達 庫中篩選直接與 Nanog, Oct4，RAR/RXR, Smad 相互作用的蛋白。4，分離、純化精原干細胞，利用 RAR/RXR 在 DNA 上結合區(qū)域的序列保守性，通過生物信息學，分析、檢索含有與 stra8 等同源的調(diào)控區(qū)的新基因，尋找已知減數(shù)分裂基因組中在精子前體細胞中表達，受視黃酸誘導調(diào)控的基因，為研究減數(shù)分裂調(diào)控機制檢索目標基因。5，開展小鼠曲細精管注射及卵母細胞胞漿注射實驗，建立精原干細胞和精子細胞的功能檢測體系，以便于對體外誘導分化所得精原（精子）細胞的生物學功能加以驗證。6，建立特定基因過量表達或缺失的轉(zhuǎn)基因及基因敲除載體。7，在人胚胎干細胞中創(chuàng)建穩(wěn)定表達標志 PGC 特化的報告基因體系。8，優(yōu)化牛 ICM 細胞體外維持多能性的細胞因子組合，嘗試獲取牛類胚胎干細胞系和體外培養(yǎng)的技術平臺。預期目標：1，建立和完善高通量研究蛋白互動網(wǎng)絡的技術平臺，包括蛋白質(zhì)組學平臺，BiFC 組學平臺, 基因組學平臺，生物信息學平臺。2，分離獲得小鼠精原干細胞；初步完成精子前體細胞中生物信息學分析，確定2-3 個受 視黃酸誘導調(diào)控并參與減數(shù)分裂調(diào)控的目標基因。3，初步建立胚胎干細胞（或誘導多能干細胞）體外培養(yǎng)和誘導分化的培養(yǎng)體系。4，建立小鼠曲細精管注射及卵母細胞胞漿注射技術體系。5，成功誘導小鼠胚胎干細胞分化成為 PGC，檢測 RA、BMP 等 5 種以上信號分子對 PGC 分化的影響。6，構建小鼠配子中特異表達的 Gpr126 等 3-5 個重要基因的條件敲除 載體或轉(zhuǎn)基因載體。7，構建 Blimp1-GFP 和 Stella-GFP 等 PGC 特化報告基因穩(wěn)定表達的人胚胎干細胞。8，獲得促使牛 ICM 細胞體外維持多能性的最佳細 胞因子組合，建立 8 個體外培養(yǎng)生長狀況良好、表達干細胞標記的牛類胚胎干細胞系。9，建立牛胚胎干細胞體外培養(yǎng)體系。10， 撰寫論文 1-2 篇。第二年：1，在前年度研究結果的基礎上，繼續(xù)完善體外胚胎干細胞（誘導多能干細胞）誘導分化精子細胞的有效途徑，利用已知精原干細胞的標志基因以及帶有精子前體細胞熒光標記蛋白的小鼠對體外誘導產(chǎn)生的細胞加以檢驗。2，通過過量表達或 RNAi 的研究手法，從 PGC 或生殖母細胞調(diào)控元及與其相互作用的蛋白質(zhì)組中篩選出控制 Blimp1, Stella, PITX2, c-kit、Stra-8, vasa 和DAZL 基因表達的關 鍵因子。3，利用生物信息學研究手法，建立以 PGC 關鍵調(diào)控元為中心的信號調(diào)控網(wǎng)絡。4，利用測序的方法（如 CpG 二核苷酸位點上的甲基化）分析精原干 細胞和胚胎干細胞的基因組 DNA，印跡基因和一些關 鍵的多能性基因的 DNA 甲基化模式。5，對經(jīng)過視黃酸刺激的精原干細胞進行基因芯片分析來研究其表達譜。利用特定的抗體進行免疫沉淀或染色質(zhì)免疫沉淀對視黃酸在生殖細胞中的受體、輔助受體復合物進行生化分析。設計、構建相關 載體、 DNA 文庫，用以篩選與視黃素受體相互作用的蛋白。6，建立清除內(nèi)源精原干細胞的野生型小鼠或缺失精原干細胞的突變型小鼠，用于曲細精管注射檢測體外培養(yǎng)的精原干細胞的生物學功能。建立穩(wěn)定的胞漿內(nèi)精子注射技術平臺。7，通過報告基因和表面抗原標記，篩選在體外培養(yǎng)體系中參與 PGC 特化的生長因子和激素等細胞外因子或小分子化合物。8，以 gonadal 細胞共培養(yǎng)的方式建立適合 PGC 生 長及減數(shù)分裂形成功能性配子的微環(huán)境。9，在優(yōu)化的體外培養(yǎng)條件下誘導 ESC 向 PGC 分化，運用基因芯片和定量 PCR等技術篩選 PGC 特異的基因（主要是 GPCR 和其他受體介 導的信號傳導分子）并研究其表達模式。10， 利用轉(zhuǎn)基因及基因敲除技術，建立特定基因過量表達或缺失的胚胎干細胞株或小鼠雜合體模型。11， 利用上述人胚胎干細胞中創(chuàng)建 PGC 特化的報告基因體系, 建立完善從人胚胎干細胞誘導 PGC 生成的培養(yǎng)體系。12， 進一步探索已建立的牛類胚干細胞系體外分化為三個胚層的能力及種系嵌合的研究。13， 探索已建立的牛胚胎干細胞體外培養(yǎng)條件可否適合體外來源的牛胚胎（體外受精胚胎和體外克隆胚胎）的可行性。14， 利用創(chuàng)建的牛 ES 細胞體系，初步探 討牛 ES 細胞自我更新和分化途徑。預期目標：1，篩選出控制 PGC 基因表達的 6-8 個關鍵因子。2，建立以 PGC 關鍵調(diào)控元為中心的較為完整的信號調(diào)控網(wǎng)絡。3，完成精原干細胞和胚胎干細胞、誘導多能干細胞的 DNA 甲基化測序。4，完成對精原干細胞的基因芯片分析，確定 2-3 個受視黃酸刺激表達明顯上調(diào)的基因。5，對視黃酸受體、輔助受體復合物進行生化分析，確定其基本成分；設計、構建用于篩選相關蛋白相互作用的載體、DNA 文庫。6，獲得清除內(nèi)源精原干細胞的野生型小鼠或缺失精原干細胞的突變型小鼠，獲得精子注射小鼠后代。7，在無血清培養(yǎng)條件下，建立 ESC 向 PGC 分化的最佳體外培養(yǎng)體系。8，鑒定 PGC 參與調(diào)節(jié) ESC 特化為 PGC 過程中的生 長因子、激素或小分子化合物。9，建立適合 PGC 生長及減數(shù)分裂的 gonadal 細胞共培養(yǎng)體系。10， 鑒定 ESC 分化為 PGC 個階段的差異表達基因，明確它 們的表達模式。11， 建立特定基因過表達和 knockdown 的 ES 細胞株，得到嵌合體小鼠（第一批）。12， 獲得 3 個以上特定基因敲除的小鼠干細胞品系。13， 完善從人胚胎干細胞誘導 PGC 生成的培養(yǎng)體系。14， 建立 1-3 個具備生殖嵌合能力的牛胚胎干細胞系。15， 與其他子課題的蛋白網(wǎng)絡調(diào)控等相關研究為基礎，初步闡明 LIF-STAT3等信號通路在維持 ES 細胞自我更新中的作用。16， 撰寫論文 6-8 篇，申請專利 1 項。第三年：1， 利用高通量的染色體免疫沉淀結合全基因組 DNA 芯片或短序列測序技術（“ChIP-chip”和“ChIP-seq”），研究 PGC 誘導過程中組蛋白修飾的動態(tài)過程。2， 利用貝葉斯網(wǎng)絡推測組蛋白各種不同修飾和基因表達之間的因果關系及組合關系，并推測組蛋白修飾相互之間形成的邏輯關系。3， 全面篩選與組蛋白修飾相關的基因，通過基因敲除或過量表達，驗證不同修飾與 PGC 或精子發(fā)育之間的相互關系，以全面了解轉(zhuǎn)錄因子和組蛋白修飾（著重于組蛋白?；⒓谆难芯浚┰?PGC 形成中的功能與調(diào)控機制。4， 用特定的抗體通過 Western 雜交和免疫細胞化學的方法比較精原干細胞和胚胎干細胞中與控制基因表達相關的組蛋白修飾模式的差異，如H3K4me，H3K9me 等。5， 根據(jù)生物信息學分析結果，挑選幾個相關基因開展分子、細胞等方面的生物學實驗詳細檢測它們對精原細胞減數(shù)分裂的影響。利用所構建的相關載體、DNA 文庫篩選與視黃素受體相互作用的蛋白。6， 根據(jù)精原干細胞與胚胎干細胞差異分析的初步結果，在已知的實驗條件基礎上改進，以期找出胚胎干細胞體外誘導精子細胞的更有效方法。7， 利用小鼠曲細精管注射實驗，檢測體外誘導分化所得精原干細胞形成克隆的能力，通過分子和細胞生物學的方法檢測其衍生細胞。通過體外受精和胞漿內(nèi)精子注射技術檢測其衍生細胞的生物學功能。8， 在第一和第二課題篩選的在 PGC 特化和配子減數(shù)分裂過程中有重要功能的轉(zhuǎn)錄因子或輔因子中，選擇幾個代表性基因構建轉(zhuǎn)基因或基因敲除載體，篩選基因打靶的 ES 細胞株；9， 對已構建的小鼠模型進行表型分析，鑒定目的基因的生理功能和下游信號傳導途徑；10， 研究參與 PGC 特化的生長因子和激素等細胞外因子或小分子化合物參與調(diào)控的分子機理，進一步優(yōu)化培養(yǎng)體系。11， 已建立的不同胚胎來源（體內(nèi)胚胎、體外受精胚胎和克隆胚胎）的牛 ES 細胞進行基因表達分析。12， 探索牛 ES 細胞體外定向誘導分化形成具有功能性配子（精子、卵子）的能力。預期目標：1，把握 PGC 誘導過程中組蛋白修飾的動態(tài)過程。2，發(fā)現(xiàn)若干個新的調(diào)控干細胞向生殖細胞分化的關鍵轉(zhuǎn)錄因子和染色質(zhì)修飾因子。3，揭示組蛋白修飾的動態(tài)過程和不同修飾與 PGC 發(fā)育之間的相互關系。4，完成精原干細胞和胚胎干細胞（誘導多能干細胞）組蛋白修飾模式的檢測和比較；5，完成生物信息學分析結果確定的相關基因?qū)毎麥p數(shù)分裂的影響研究，初步完成相關載體、DNA 文 庫的構建，篩選與視黃素受體相互作用的蛋白，確定 1-2 個參與減數(shù)分裂調(diào)節(jié)的新基因；6，體外誘導胚胎干細胞（誘導多能干細胞）產(chǎn)生具有精子分化表型的精原細胞，并通過小鼠曲細精管注射實驗，檢測體外誘導分化所得精原細胞形成克隆的能力，通過體外受精和胞漿內(nèi)精子注射技術檢測其衍生細胞的受精和支持胚胎發(fā)育的能力。7，構建 3-5 個第一和第二課題篩選得到的重要基因敲除載體（第二批）；8，初步完成小鼠模型的表型分析，找到這些基因可能調(diào)控的信號途徑；9，闡明新發(fā)現(xiàn)的生長因子和激素等細胞外因子或小分子化合物參與調(diào)控 PGC分化的分子機理，進一步優(yōu)化培養(yǎng)體系；10，探明不同來源的牛 ES 細胞分子生物學方面的差異， 為其體外誘導分化做準備。11，初步建立牛 ES 細胞體外定向 誘導分化形成具有功能性配子（精子、卵子）的技術體系。利用卵母細胞帶下注射或胞質(zhì)注射的方法驗證誘導分化的生殖細胞的能力。12，撰寫論文 8-10 篇，申請專 利 1-2 項。第四年：1，利用四環(huán)素調(diào)節(jié)表達系統(tǒng), RNAi, ChIP 等技術闡述端粒蛋白以及端粒酶在干細胞向 PGC 誘導過程中的作用與機理。2，通過 cDNA 基因芯片篩選的方法系統(tǒng)分析胚胎干細胞（誘導多能干細胞）和精原干細胞的基因表達譜。從兩種細胞中分離出的 RNA 與小鼠的表達 DNA 陣列雜交，以檢測基因表達的上調(diào)或下降。3，對視黃酸在生殖細胞中的受體及輔助受體復合物的形成及其中各成分的生物學功能的分子調(diào)節(jié)機制加以研究。4，通過卵母細胞胞漿內(nèi)精子注射技術檢測體外誘導分化的生殖細胞是否可替代內(nèi)源精子細胞支持胚胎發(fā)育，產(chǎn)生后代。5，建立特定基因過量表達或缺失的小鼠純合體模型, 并研究上述特定基因過量表達或缺失的胚胎干細胞及小鼠純合體的表型及對 PGC 及功能性配子形成的影響，探討關鍵基因（如激素受體）在小鼠 PGC 特化及減數(shù)分裂形成功能性配子過程中的功能及體內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式。6，利用上述人胚胎干細胞中創(chuàng)建 PGC 特化的報告基因體系及 PGC 生成的培養(yǎng)體系，優(yōu)化從人胚胎干細胞誘導分化 PGC 的條件，探討關鍵轉(zhuǎn)錄因子及信號網(wǎng)絡的調(diào)控機理。7，利用卵母細胞帶下注射或胞質(zhì)注射的方法對誘導分化的生殖細胞所形成的囊胚進行分子生物學、生理學分析及安全性檢測。并為其體內(nèi)發(fā)育做準備。8，召開國際生殖學研討會。預期目標：1，明確端粒蛋白以及端粒酶在干細胞向 PGC 誘導過程中的作用機理。2，完成胚胎干細胞（誘導多能干細胞）和精原干細胞的基因表達譜的檢測和比較。3，探索視黃酸在生殖細胞中的受體及輔助受體復合物的形成及其中各成分的生物學功能的分子調(diào)節(jié)機制。4，體外誘導分化獲得生殖細胞，并通過卵母細胞胞漿內(nèi)精子注射技術獲得后代。5，完成第一批小鼠模型的表型分析和機理研究。6，初步完成重要基因在 ESC 特化為 PGC 體外功能和機理研究。7，得到優(yōu)化的人 ESC 分化 PGC 的培養(yǎng)體系，初步闡明細胞外因子的作用機理；8，獲得以牛 ES 細胞誘導而來的生殖細胞體外所形成的囊胚，利用分子生物學手段驗證這些胚胎的生物活性，如甲基化、乙?；约岸肆Ｃ搁L短和活性等，并與正常體內(nèi)胚胎進行比較，初步闡明這種牛 ES 細胞 誘導分化而來的生殖細胞所形成的胚胎是否具有優(yōu)勢、是否具備安全性。9，召開一次生殖學研討會。10， 撰寫論文 8-10 篇，申請專利 1-3 項。第五年：1，利用以上的研究手法，與課題 4 共同篩選在誘導牛干細胞分化過程中的Nanog, Oct4，RAR/RXR 的結合蛋白， 檢索調(diào)控 Blimp1 、Stella, PITX2, c-kit、Stra-8, vasa 等基因表達的調(diào)控因子。明確 組蛋白修飾及端粒蛋白和端粒酶的作用。2，通過蛋白組學，分離，純化胚胎干細胞和精原干細胞的細胞膜成分，利用蛋白雙向凝膠電泳技術和質(zhì)譜分析，深入研究細胞表面蛋白表達的差別，綜合前四年研究結果分析胚胎干細胞和精原干細胞在 DNA 甲基化模式、基因表達和 細胞表面蛋白成分的差異，闡明造成精原干細胞和胚胎干細胞的不同發(fā)育潛力的主要原因。3，綜合分析闡明通過視黃酸調(diào)控雄性生殖細胞減數(shù)分裂的機制。4，進一步研究體外誘導分化的生殖細胞通過胞漿內(nèi)精子注射技術獲得的后代的表型及生理功能，評估體外誘導分化獲得的生殖細胞對其后代的影響。5，研究特定基因過量表達或缺失的胚胎干細胞及小鼠純合體表型,并探討相關的體外分子機制實驗。6，結合其他課題組的研究成果,利用已完善的 PGC 及功能性配子誘導體系,檢測新發(fā)現(xiàn)的重要基因(如 Oct4,Nanog 的相互作用分子等)的功能及分子作用機理。7，牛 ES 細胞誘導分化而來的生殖細胞所形成的胚胎體內(nèi)發(fā)育能力，并與體內(nèi)來源胚胎在體內(nèi)正常發(fā)育進行比較研究。8，總結研究結果，匯總數(shù)據(jù)，提交研究報告，撰寫論文。預期目標：1，在整體細胞水平上初步確立干細胞向生殖細胞分化的網(wǎng)絡系統(tǒng)。2，完成胚胎干細胞（誘導多能干細胞）和精原干細胞表面蛋白表達的檢測和比較；綜合前四年研究結果，闡明造成精原干細胞和胚胎干細胞的不同發(fā)育潛力的主要原因；綜合分析闡明通過視黃酸調(diào)控雄性生殖細胞減數(shù)分裂的機制；完成對卵母細胞胞漿內(nèi)精子注射技術獲得后代的表型分析。3，完成第二批小鼠動物模型表型分析和機理研究；4，重要基因在 ESC 特化為 PGC 體外功能和機理研究；5，將牛 ES 細胞誘導分化而來的生殖 細胞所形成的胚胎移植于同期 誘導發(fā)情的母體內(nèi)，力爭獲得后代。6，比較分析兩種胚胎生成后代牛的異同，初步闡明以牛 ES 細胞誘導分化而來的生殖細胞所形成的胚胎是否具備可行性和優(yōu)越性。以期真正意義上建立牛 ES細胞體外誘導分化功能性生殖細胞的技術平臺，為經(jīng)濟動物的改良服務。7，整理論文 8-10 篇，申 請專利 3-5 項。