在黑色素瘤中異常表達(dá)的MHCII類受體.doc

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在惡性黑色素瘤中MHC II類分子的異常表達(dá)吸引炎性腫瘤特異性CD4 + T-Cells并降低CD8+ T細(xì)胞的抗腫瘤反應(yīng) Aberrant Expression of MHC Class II in Melanoma Attracts Inflammatory Tumor-Specific CD4+ T-Cells, Which Dampen CD8+ T-cell Antitumor Reactivity 摘要 在不存在局部炎癥反應(yīng)情況下，MHC類型Ⅱ分子表達(dá)主要限制在造血細(xì)胞和胸腺上皮細(xì)胞。然而，某些腫瘤，如黑色素瘤，可能獲得MHC II類的異常組成性表達(dá)。在一組初級黑素瘤細(xì)胞群體的和相應(yīng)地擴大了自體腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（TIL）中，我們將展示在具有高度MHC II類分子特異性及腫瘤有特異性T細(xì)胞應(yīng)答的黑色素瘤細(xì)胞中， MHC II是如何表達(dá)的。值得注意的是，我們發(fā)現(xiàn)，腫瘤特異性CD4+ T細(xì)胞應(yīng)答是由TNF產(chǎn)生支配。在IFNγ豐富的環(huán)境中，TNF降低CD8+ T細(xì)胞激活類似腫瘤部位的能力。相反，直接的CD4+ T細(xì)胞反應(yīng)對無論是黑色素瘤細(xì)胞的增殖或活力無影響?？傊?，我們的結(jié)果表明了一種被MHC II類分子的異常表達(dá)激活的新免疫逃離機制的存在，這種機制靠吸引腫瘤特異性CD4 + T細(xì)胞引發(fā)腫瘤壞死因子主導(dǎo)的局部炎癥反應(yīng)轉(zhuǎn)而去抑制CD8 +T細(xì)胞的反應(yīng)。Cancer Res; 75(18); 3747–59. 2015 AACR. 引言 在沒有局部的炎癥反應(yīng)的情況下，MHC II型表達(dá)主要限于造血細(xì)胞和胸腺上皮。然而，某些類型的實體瘤，包括黑色素瘤亞單位，能從頭組成表達(dá)MHC II類分子。另外，通過暴露于細(xì)胞因子例如IFNγ的方法，MHC II類可在幾種細(xì)胞類型(包括腫瘤細(xì)胞)中被誘導(dǎo)表達(dá)。 在黑色素瘤的MHC II類表達(dá)先前已發(fā)現(xiàn)與較短和較長的存活都相關(guān)聯(lián)。的確，MHC II類表達(dá)可以使這些腫瘤被的腫瘤抗原特異性CD4 + T細(xì)胞直接檢測。我們和其他人曾證明這種CD4+ T細(xì)胞能夠產(chǎn)生Th1應(yīng)答響應(yīng)于自體腫瘤抗原。與此相反，最近的研究提出，分別表達(dá)在腫瘤細(xì)胞和腫瘤浸潤免疫細(xì)胞的MHC II類分子與由淋巴細(xì)胞激活基因3（LAG3）的接合，可能會觸發(fā)促存活信號和腫瘤細(xì)胞的抗細(xì)胞凋亡。此外，LAG3已被表征為免疫抑制性受體，并且其在T細(xì)胞上的接合可以在啟動階段而不是在效應(yīng)階段介導(dǎo)腫瘤微環(huán)境中的免疫反應(yīng)的下調(diào)。 為了闡明MHC II型表達(dá)與CD4+ T細(xì)胞應(yīng)答和CD4+ T細(xì)胞的功能性模式在黑素瘤中的關(guān)聯(lián)，我們進行了擴大的腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（TIL）的一種多功能分析直接識別了一組的38自體配對的晚期患者產(chǎn)生的黑色素瘤細(xì)胞系。我們的研究結(jié)果揭示了一個新機制，MHC II表達(dá)的黑色素瘤對炎性CD4+ T細(xì)胞存在吸引，并且通過IFNg-介導(dǎo)及TNF誘導(dǎo)免疫反應(yīng)局部擴大來反作用CD8+ T細(xì)胞應(yīng)答，起到抑制作用。 材料和方法 病人和樣品 科學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)了在丹麥的首都地的所有的程序。根據(jù)赫爾辛基宣言在任何操作之前患者簽署書面知情同意書。所有患者都被診斷為組織學(xué)確診的晚期黑色素瘤，AJCCⅣ期（N32）或IIIB（N= 1，完全切除），IIIC（N5，其中兩種是完全切除）。 從ESTDAB得到（http://www.ebi.ac.uk/ipd/estdab/）原發(fā)黑素瘤的WM-115，F(xiàn)M-55-P，F(xiàn)M-55-M1，和FM-55-M2的腫瘤細(xì)胞系。 WM-115，WM-75，WM-793，和WM-266-4已被描述過特征。 用于流式細(xì)胞術(shù)的抗體 用流式細(xì)胞儀抗體小組分別為： - CD4 +和CD8 + T細(xì)胞應(yīng)答的多方面特性：CD4 QDOT 705（Life Technologies公司），CD8 QDOT605（Life Technologies公司），近紅外活/死可固定死細(xì)胞染色即（Life Technologies公司），MIP-1A FITC（eBioscience公司），MIP-1B PerCP-eFluor 710（eBioscience公司），CD107a Brilliant Violet 421，IFNG PE-Cy7，TNF-APC，IL2 Brilliant Violet 650（Biolegend公司），IL17A Brilliant Violet 510。 - 所有其他腫瘤的T細(xì)胞共培養(yǎng)實驗：CD4 FITC，CD8PerCP，可固定活力染料eFluor 450（eBioscience公司），IFN PE Cy7，TNF-APC，CD107a PE。 - MHC I類特性：抗HLA-ABC的APC，7-AAD - MHC II類特性：抗HLA-DP，DR，DQ FITC，7-AAD TIL和黑色素瘤細(xì)胞系的制備 本研究使用的TIL是按照在其他研究中廣泛描述的實驗過程得到的。簡要地說，在無菌條件下將手術(shù)的切除黑色素瘤腫瘤切成1?2立方毫米小碎塊，將浸潤淋巴細(xì)胞從這些腫瘤中分離開，并在高劑量的IL2（??6000 IU / mL的IL-2; Proleukin諾華）保持最低限度地擴增。當(dāng)獲得最少50X106腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞時（該產(chǎn)物在通常手術(shù)切除之后約14-28天此階段被命名為“微創(chuàng)培養(yǎng)的TIL”），擴增是由標(biāo)準(zhǔn)的14天快速擴增實驗（REP）進一步實現(xiàn)的，在其中的TIL在用200倍過量的同種異體的來自至少三個不同健康供體照射處理過的外周血單核細(xì)胞（PBMC）和30納克/毫升抗CD3抗體（OKT3，Janssen-Cilag or Miltenyi Biotec）非特異性地擴增。在本篇文章中，該TIL被命名為“擴大的TIL（expanded TILs）”或“REP-TIL。”從一些病人的腫瘤碎片提取“未培養(yǎng)（或鮮）腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞”。腫瘤碎片用添加了1毫克/毫升膠原酶IV型（Sigma-Aldrich公司）和0.0125毫克/毫升dornase阿爾法（Pulmozyme，羅氏）的消化液消化過夜并立即冷凍保存。 在REP之前，根據(jù)制造商的說明利用陽性磁力選擇（positive magnetical selection）分別使用CD8或CD4的磁珠（美天旎）篩選TIL，得到純CD8 +或CD4 + T細(xì)胞群。并得到設(shè)計實驗中所要使用的分好類的T細(xì)胞。隨后，分選亞群們分別進行擴增。只有CD8+或CD4 + T細(xì)胞的濃度達(dá)到95％以上的培養(yǎng)物被用于接下來的實驗。 自體黑素瘤細(xì)胞系分別TIL從產(chǎn)生，無論是從腫瘤碎片或從運輸培養(yǎng)基中懸浮回收細(xì)胞團或從組織碎片中，如先前文獻所述（16，18）。 通過流式細(xì)胞儀分析T細(xì)胞應(yīng)答 如先前文獻所述（10，16），進行T細(xì)胞反應(yīng)的測定。 簡要地說，TIL解凍，并在RPMI-1640（Life Technologies公司）靜置3天（用于REP的TIL的多官能表征），2天（最低限度培養(yǎng)的TIL），或過夜（在所有其它情況下）中補充有10％AB人血清（SigmaAldrich），之后洗滌兩次，與自體短期培養(yǎng)的黑素瘤細(xì)胞系共培養(yǎng)。腫瘤反應(yīng)性通過評估先前門控為CD4或CD8 T細(xì)胞表達(dá)的細(xì)胞因子（IFNG和TNF）或CD107a 的表達(dá)量來評估。 為了篩選CD8 +和CD4 + T對自體腫瘤抗原的細(xì)胞反應(yīng)，對數(shù)期生長的自體腫瘤在100IU /毫升IFNG（Imukin，勃林格殷格翰）孵育72小時，然后充分洗滌，并添加到共培養(yǎng)物中。這樣做是為了能最大限度地檢測到低頻的與MHC表達(dá)下調(diào)的自體腫瘤與或沒有組成型MHC II類表達(dá)抗腫瘤反應(yīng)。反應(yīng)被定義為在相對CD8 +或CD4 + T細(xì)胞亞群中，最少有0.5％的應(yīng)答細(xì)胞的存在（表達(dá)出下列T細(xì)胞功能中的至少一種：TNF，IFNG，或CD107a），最少50的陽性事件發(fā)生和與背景（即，未刺激的樣品）相比至少三倍的T細(xì)胞的功能陽性細(xì)胞的頻率。腫瘤反應(yīng)性細(xì)胞在刺激的樣品中的頻??率中減去由未刺激樣品的。 0.5％作為判定顯著性的底限。 對于MHC II類阻斷實驗，腫瘤細(xì)胞37℃在20毫克/毫升抗HLA DR，DP，DQ抗體（克隆TU39，從Biolegend公司）溫育30分鐘，或在相關(guān)同種型對照中溫浴。然后，腫瘤細(xì)胞加入和沒有附加洗滌的TIL（最終濃度在T細(xì)胞刺中激雞尾酒約為0.5毫克/毫升）到共培養(yǎng)物中。進行聚合四聚體（肽-MHC多聚體的PE綴合并在內(nèi)部產(chǎn)生HLA-A2限制性MART-1 / Melan-A衍生肽ELAGIGILTV）和細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色（CD107a聚乙烯是在此情況下與CD107a FITC替換）染色，評估MART-1特異性T細(xì)胞產(chǎn)生功能的反應(yīng)的頻率，如先前文獻所述（10）。 在多官能表征實驗（7個T細(xì)胞功能表征），在共培養(yǎng)基中與自體腫瘤細(xì)胞的孵育時間被延長至12個小時，以便能夠檢測早期和晚期的細(xì)胞因子產(chǎn)生。 那里要指出的是用1000UI/毫升的TNF（CellGenix）或100IU / mL的IFNG或兩者都處理72小時的癌癥細(xì)胞。由于由CD8 + T細(xì)胞的多個T細(xì)胞功能的同時陽性評估的高靈敏度，要同時表達(dá)TNF，IFNG，和CD107a中的至少兩個功能（雙陽性細(xì)胞）被選為總CD8腫瘤反應(yīng)性的量度，以評價腫瘤壞死因子（TNF）對CD8 + T細(xì)胞識別的影響。 T細(xì)胞反應(yīng)的多官能表征細(xì)胞使用BD FACSCanto II流式細(xì)胞儀或用5 laser BD LSR II。流式細(xì)胞儀配備了FACS Diva的軟件6.3（BD）。 ELISPOT和細(xì)胞毒性試驗 如先前文獻所述（16）進行IFNγ ELISPOT實驗。共有3104的TIL（分別是3104 CD8 + T細(xì)胞，3104 CD4 + T細(xì)胞，或1.5104 CD8 +加1.5104 CD4 + T細(xì)胞，使得腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞的總量是在每一個孔相同）和3103癌細(xì)胞加入各孔。一式三份孔進行了分析。結(jié)果為在受刺激的孔中IFNγ斑點減去背景。 對CTL介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用的常規(guī)的51 Cr釋放測定法進行如別處（19）中所述。 癌細(xì)胞的分析 MHC表達(dá)分析。半定量測定癌細(xì)胞的MHC I類或II類表達(dá)，進行標(biāo)準(zhǔn)染色鑒定，新鮮分離的腫瘤細(xì)胞與抗HLA-ABC或HLA-DP，DR，DQ抗體或同種型對照，洗滌，在采樣前5分鐘加入2mL的7-AAD到每個樣品中。用BD FACSCanto II流式細(xì)胞儀收集細(xì)胞，并考慮到不同的自體熒光的個體細(xì)胞系的電壓參數(shù)，對每個細(xì)胞系進行了調(diào)整以獲得27515的APC平均熒光強度（MFI）和655的FITC MFI。 鑒于幾個腫瘤細(xì)胞株中的非均勻MHC II類染色，當(dāng)所研究的抗體樣品染色的MFI超過同種型對照至少四倍染色，黑素瘤被確定為MHC II型陽性。 細(xì)胞增殖分析 如先前所述（10）使用流式細(xì)胞術(shù)為基礎(chǔ)的計數(shù)法對細(xì)胞增殖進行了評價。簡要地說，在標(biāo)準(zhǔn)胰蛋白酶消化后，實驗開始前一天（-1day），將黑色素瘤細(xì)胞接種在5至8104 /孔的24孔板中，生長24小時后，加入標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基。然后，培養(yǎng)基換成新鮮標(biāo)準(zhǔn)介質(zhì)從對應(yīng)的患者取得的活化的CD4 + T細(xì)胞上清液的稀釋液，從而使得0.5 mL的終濃度/孔?；€對照孔在0天用50毫升每孔胰蛋白酶溶液進行胰蛋白酶處理，同時使用含0.05毫克/毫升碘化丙啶（PI; Sigma-Aldrich）250毫升標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基加入到每個孔中，以排除死細(xì)胞。所得懸浮液在BD的FACSCanto II流式細(xì)胞儀配備有BD FACS裝載機轉(zhuǎn)盤，標(biāo)準(zhǔn)的速率下計數(shù)一定時間（90秒，高流動速率）。在藥物中暴露72小時后，將其他孔用胰蛋白酶處理和之后的基線對照孔在相同的工作條件的細(xì)胞進行計數(shù)。用下列公式計算生長抑制：（T72- T0）/（K72 -T0）100，其中T72是72小時后的細(xì)胞數(shù)，T 0是在零時間對照的細(xì)胞數(shù)，K72是對照孔（培養(yǎng)基）72小時后的細(xì)胞數(shù)。對照值被任意設(shè)定為100。低于0表示元細(xì)胞丟失而0到100之間的值表示生長抑制。 要從激活CD4 + T細(xì)胞得到上清液： 在24孔板中，5106分類后的從個體患者處得到的CD4 + T細(xì)胞和用5105自體IFNγ處理（72小時）的腫瘤細(xì)胞孵育，每孔總體積1毫升。 24小時后，收集上清液，用兩個離心步驟（1,500rpm / 5分鐘）將細(xì)胞洗出，隨后將上清液冷凍保存在-80℃，供以后使用。 RT-PCR技術(shù)。使用根據(jù)制造商的TRIzol試劑（Invitrogen）使用說明從樣品中提取總RNA。逆轉(zhuǎn)錄反使用Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit（Roche）。實時PCR（qPCR;對于IDO-1，PDL-1，MLANA，TYR，PMEL，TAPBP，PSMB9，和GAPDH）分析利用了內(nèi)部設(shè)計的引物和LightCycler Nano instrument（Roche）。 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 執(zhí)行了達(dá)戈斯蒂諾皮爾森正態(tài)性檢驗檢查值的正態(tài)分布，還有F測試，以檢查方差齊性。視上面的測試結(jié)果再作出是否在相關(guān)的數(shù)據(jù)集執(zhí)行參數(shù)或非參數(shù)試驗的決定。結(jié)果不同群體之間的比較采用雙側(cè)測試（或者配對t檢驗，非配對t檢驗，Mann-Whitney檢驗，或魏氏配對測試）。對生存分析進行對數(shù)秩檢驗。定性數(shù)據(jù)與Fisher精確檢驗進行了比較。 用對數(shù)變換的數(shù)據(jù)來比較組間的差異，用來分析相對定量的能力來表達(dá)單個T細(xì)胞的功能。對于qPCR的數(shù)據(jù)，靶基因的Ct被減去GAPDH Ct獲得△Ct。采用配對符號秩和檢驗來比較IFNγ處理的細(xì)胞和培養(yǎng)基，TNF-γ，和TNF+IFNγ-處理細(xì)胞之間的差異。數(shù)據(jù)顯示為相對于IFNγ處理細(xì)胞(任意設(shè)置值為1)。 在多官能表征實驗（7 T細(xì)胞功能表征），流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)用FlowJo 9（TreeStar Inc.）進行初加工。使用順序選通策略直到識別了使用并行布爾門（門僅圍繞應(yīng)答細(xì)胞繪制）分類的CD4 +和CD8 + T細(xì)胞細(xì)胞。根據(jù)pestle說明，數(shù)據(jù)導(dǎo)出到pestle 1.7并正確格式化。使用SPICE 5.2版本（從http://exon.niaid.nih.gov（20）下載）進行分析和介紹結(jié)果。在REP TIL和最低限度的TIL培養(yǎng)的分析中，根據(jù)制造商的說明，用Pestle1.7進行未刺激樣品減去背景。與此相反，在未培養(yǎng)的TIL的分析中，背景樣品不能被減去，因為腫瘤消化不可避免也含有未培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞，這些細(xì)胞可以在12小時的培養(yǎng)中刺激TIL（數(shù)據(jù)未顯示）。至少1％應(yīng)答細(xì)胞在CD4 +或CD8 + T細(xì)胞亞群的閾被接受，這樣背景T細(xì)胞功能的表達(dá)噪聲的影響不會超過約30％至40％（從young TIL或REP TIL樣本背景染色中估計）。雖然有這些閾值，背景事件對總響應(yīng)的貢獻也許會相對高（尤其是對于CD107a+細(xì)胞，觀察了未刺激的樣品中在最低限度培養(yǎng)的TIL和REP TIL陽性細(xì)胞的比例）。分析可能僅在這些情況下進行，因為在未培養(yǎng)的TIL中腫瘤反應(yīng)性細(xì)胞的頻率普遍較低（在5個病例樣本中分析，11，15，19，24，和25，CD4 + T細(xì)胞的陽性細(xì)胞的平均頻率是2.2％ 1.6％，CD8 + T細(xì)胞的陽性細(xì)胞的平均頻率是5.3％5.1％）。 在SPICE，REP TIL的分析閾值設(shè)定在0.1，而在所有其他的分析中，閾值設(shè)定為0.02。如先前所描述（20），使用Student t檢驗和的局部置換檢驗進行分布的比較。其他統(tǒng)計分析均采用的GraphPad Prism 5（GraphPad軟件）。 結(jié)果 篩選與自體腫瘤抗原的細(xì)胞反應(yīng)的CD8 +和CD4 + T細(xì)胞 盡管事實上，體內(nèi)腫瘤的異質(zhì)性可能不能完全通過短期培養(yǎng)的自體黑素瘤細(xì)胞系體現(xiàn)，但如果能認(rèn)為T細(xì)胞應(yīng)答直接作用于大多，可能不是全部，可能病人的對應(yīng)腫瘤抗原，TILs/自體腫瘤細(xì)胞系的共培養(yǎng)能表現(xiàn)出一個金標(biāo)準(zhǔn)。為了獲得最大的T細(xì)胞反應(yīng)，自體腫瘤用低劑量IFNγ預(yù)處理，我們以前已經(jīng)展示過這會增加TIL識別和反應(yīng)性。此后，腫瘤被暴露在自體腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（10）。 分別在34（89％）和18（53％）患者（圖1A; P = 0.001）中篩選38種體外擴大TILs /自體腫瘤，且該腫瘤與特定可檢測的直接的CD8 +和CD4 + T細(xì)胞反應(yīng)成堆出現(xiàn)。細(xì)胞反應(yīng)的強度作為測量表達(dá)腫瘤壞死因子，IFNG，或CD107a的腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（TIL）頻率的標(biāo)準(zhǔn)。細(xì)胞反應(yīng)的強度，CD8 +T細(xì)胞中 18％18％（平均值，中位數(shù)為10％），CD4 + T細(xì)胞中4.0％ 9％（平均值，中位數(shù)為0.66％）（圖1B，P <0.0001）。因此，CD8 + T細(xì)胞應(yīng)答二者比CD4 + T細(xì)胞應(yīng)答更頻繁而且強烈地出現(xiàn)。 在6個被分析的樣品中，有6個樣品腫瘤細(xì)胞上MHC II類的的封鎖顯著降低CD4 + T細(xì)胞反應(yīng)（樣品取自6個高CD4 + T細(xì)胞應(yīng)答患者），證實II類依賴識別（圖1C和D）。 高CD4 + T細(xì)胞應(yīng)答的存在（14例，確定在整個CD4 + T細(xì)胞亞群具有至少2％的細(xì)胞響應(yīng)自體腫瘤）不與TIL中的CD4 + T細(xì)胞的較高頻率有關(guān)（圖1E）。這可能表明，在體內(nèi)CD4 + T細(xì)胞浸潤的量值，這很可能反映在擴增TIL細(xì)胞中的CD4 / CD8 T細(xì)胞比率，并不與CD4 + T細(xì)胞應(yīng)答存在有關(guān)，而是與大多數(shù)代表非腫瘤相關(guān)的免疫細(xì)胞的CD4+ TIL有關(guān)。值得注意的是，我們以前已經(jīng)表明，非腫瘤相關(guān)病毒特異性CD8 + T細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境（21）的高頻存在。 另外，高CD4 + T細(xì)胞反應(yīng)的患者的CD8 + T細(xì)胞應(yīng)答的特性與無或低CD4 + T細(xì)胞應(yīng)答的患者（圖1F和補充圖S1）并沒有顯著不同。 高CD4 + T細(xì)胞反應(yīng)（利用流式細(xì)胞儀）的患者的在擴增的TIL上FoxP3的表達(dá)的分析顯示，在解凍后立即染色TIL CD4 +和CD8 +都相對較高的組分，呈陽性。不過，在IL2缺失的培養(yǎng)基7天后FoxP3的表達(dá)完全喪失（數(shù)據(jù)未顯示）。因此，我們將此FoxP3的臨時表達(dá)解釋為體外培養(yǎng)條件所引起的高T細(xì)胞活化的作用，而不是與經(jīng)典的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的功能相關(guān)聯(lián)。 圖1：對黑色素瘤CD4+ T細(xì)胞反應(yīng)。A，具有對自體黑色素瘤細(xì)胞系CD4+或CD8+ TIL細(xì)胞應(yīng)答患者的頻率。B，對自體黑色素瘤細(xì)胞系有CD8+或CD4+ 腫瘤應(yīng)答的TIL的頻率。腫瘤細(xì)胞在與TIL共培養(yǎng)前用100 IU/mL IFNγ預(yù)處理，在材料和方法說明過。腫瘤應(yīng)答細(xì)胞表達(dá)以下至少一個T細(xì)胞的功能：TNF，IFNγ，或CD107a。線條顯示中值。C和D，MHC II類對腫瘤靶細(xì)胞阻斷后CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生的TNF。C，在六個類似的結(jié)果中一個代表性的樣本，CD4+ T細(xì)胞門控。線在D中顯示中位值。E，高或無/低CD4+ T細(xì)胞反應(yīng)的患者的CD4+ T細(xì)胞的在所有TIL細(xì)胞中的頻率。線顯示平均值。F，在高或無/低CD4+ T細(xì)胞反應(yīng)的患者中，腫瘤應(yīng)答CD8+ T細(xì)胞的頻率。線顯示平均值。 MHC II類黑色素瘤細(xì)胞株中的表達(dá) 之前的研究表明，在43%黑色素瘤細(xì)胞株MHC II類分子組成型表達(dá)，而且絕大多數(shù)暴露在IFN-γ-a細(xì)胞因子的黑色素瘤（> 70%）表達(dá)II類，而在腫瘤微環(huán)境中的IFN-γ-a細(xì)胞因子可能是高水平，與CD8+ T細(xì)胞抗腫瘤反應(yīng)密切相關(guān)（1）。 38例黑色素瘤中19例（50%）組成表達(dá)MHC II類分子（表1和圖2A）。在IFNγ處理后，的MHC II型陽性和陰性腫瘤的MHC II類表達(dá)相對倍（數(shù)據(jù)未顯示）和高或無/低CD4+ T細(xì)胞反應(yīng)的MHC II類表達(dá)相對倍（補充圖S2A）是相似。在19個組成II類陰性腫瘤只有3個IFNγ處理后在不表達(dá)MHC II類分子。 為了弄清MHC II類的異常表達(dá)是否轉(zhuǎn)移性黑素瘤的特異事件，兩種來自原發(fā)黑素瘤（WM-115和FM-55-P）細(xì)胞系進行MHC表達(dá)特征檢測。兩種細(xì)胞系MHC I類表達(dá)都表現(xiàn)出與轉(zhuǎn)移性起源細(xì)胞相比類似的模式（組成性表達(dá)，IFNγ處理后表達(dá)增強）。 WM-115 MHC II類組成性陽性，而FM-55-P為陰性，并且暴露于IFNγ之后兩個染色后為陽性（WM-115具有增加的表達(dá)）（數(shù)據(jù)未顯示）。對兩個附加的細(xì)胞系，來自同一患者FM-55的單獨的轉(zhuǎn)移灶（FM-55-P代表原發(fā)黑素瘤），即FM-55-M1和FM-55-M2，進行了分析。都顯示沒有MHC II類組成型表達(dá)（但在IFNγ處理后有），正像他們的對應(yīng)起源。 為了擴展分析和證實我們的結(jié)果，對ESTDAB數(shù)據(jù)庫（http://www.ebi.ac.uk/ipd/estdab/）進行了檢查。事實上，我們對WM-115和FM-55-P組成型表達(dá)的數(shù)據(jù)匹配ESTDAB的報告。此外，據(jù)報道在兩個自于初級黑素瘤（WM-75和WM-793）其它細(xì)胞系中有兩個組成型表達(dá)至少一種II類MHC同種型，正如WM-266-4一樣，是一個起源于我們分析的一個患者的一個轉(zhuǎn)移灶的細(xì)胞系，這個患者的轉(zhuǎn)移灶在建立初級細(xì)胞系（WM-115）的18個月后診斷出。這些結(jié)果證實了以前布洛克爾和他的同事（22）的原位數(shù)據(jù)，并表明活化MHC II類的組成型表達(dá)可能在黑素瘤是非常早期的事件。 CD4 + T細(xì)胞應(yīng)答和MHC II類的組成型表達(dá)的關(guān)聯(lián) 為了表征MHC II類的組成型腫瘤表達(dá)是否與在TIL中CD4 +腫瘤特異性T細(xì)胞增加的頻率相關(guān)聯(lián)，我們在匹配的樣本（擴增的TIL）中檢查CD4 + T細(xì)胞應(yīng)答。 在腫瘤組成表達(dá)MHC II類中的TIL中檢測到較高的腫瘤特異性CD4 + T細(xì)胞應(yīng)答頻率（II類組成型陽性：平均7.5％11％ vs. II類組成陰性1％1％；P = 0.002；高CD4 + T細(xì)胞反應(yīng)在12/ 19 II類組成型陽性腫瘤vs. 2/19 II類組成型陰性的腫瘤；P = 0.002；圖2B；表1）。在所有的情況下，腫瘤識別實驗在IFNγ預(yù)處理后進行，如果腫瘤特異性CD4 + T細(xì)胞存在，使得最終能檢測T細(xì)胞反應(yīng)，因為絕大部分腫瘤高水平表達(dá)MHCII分子無論MHCII分子組成性陽性（如上）。 這些數(shù)據(jù)表明，II型表達(dá)是一個早期事件經(jīng)常隨后出現(xiàn)腫瘤抗原特異性CD4 + T細(xì)胞的浸潤。然而，這不是一個絕對的要求，因為在某些組成型II類表達(dá)的黑素瘤中沒有強CD4 + T細(xì)胞應(yīng)答出現(xiàn)（7/19; 37％）表明，這是不夠的，并且在沒有組成型II類表達(dá)的兩種黑素瘤高頻中存在CD4 +T細(xì)胞反應(yīng)（Pt.24和Pt. 25; 2/19; 10.5％）表明這不是強制性的。 特別令人感興趣的，我們的隊列中兩個樣品（Pt.30和Pt.35）由來自同一患者（表1）但不同時間。第一次轉(zhuǎn)移（命名為Pt.30）切除后進行TIL試驗（clinicaltrials.gov identifier：NCT00937625）。不久之后，病人被注入擴增的TIL，此治療導(dǎo)致> 80％所有先在腫瘤病灶的的復(fù)原，但有新的轉(zhuǎn)移病灶出現(xiàn)在第一評價（數(shù)據(jù)未顯示）。這種病變繼續(xù)增長，在輸液TIL 約6個月后，切除（命名為Pt.35）。如表1中所示，這兩種細(xì)胞系均組成表達(dá)MHC II類，但只有難以治療的和漸進轉(zhuǎn)移性病灶被腫瘤特異性CD4 + T細(xì)胞浸潤，并且高頻出現(xiàn)（表1）。這是一個有趣的觀察軼事，表明腫瘤特異性CD4 + T細(xì)胞的浸潤，可以進行時空動態(tài)調(diào)節(jié)，并且與腫瘤細(xì)胞中無明顯MHC II類表達(dá)變化的疾病進展有關(guān)。 圖2：在黑色素瘤細(xì)胞MHC I類和II類表達(dá)和與CD4 + T細(xì)胞應(yīng)答的相關(guān)性。 A，在兩個具有代表性的患者（組成型II類陽性或MHC組成陰性的黑素瘤）的MHC II類分子（HLA DP，DR，DQ）表達(dá)在任何一個第二類陽性黑素瘤一個。虛線，同型控制；灰色實線，組成型表達(dá)；黑色實線，預(yù)處理IFNγ100IU / mL的72小時后的表達(dá)。B，MHC II類分子的組成性表達(dá)腫瘤響應(yīng)CD4 + T細(xì)胞的患者的的頻率。線顯示中值。 C和D中，高或無/低CD4 + T細(xì)胞應(yīng)答的患者黑色素瘤細(xì)胞系的相對組成型或IFNγ誘導(dǎo)的I類表達(dá)。線表示平均值。 CD4 +和CD8 + T細(xì)胞對黑素瘤反應(yīng)的多官能表征 為了確定CD4 +和CD8 + T細(xì)胞應(yīng)答的潛在功能模式，我們從8例中選擇在兩個亞群中都有強應(yīng)答（>2％ CD4 +或CD8 +門控的TIL同時表達(dá)TNF和IFNG，和至少10％的CD4 +和/或CD8 + T細(xì)胞亞群頻率；從Pts.1，5，11，15，18，19，24，和25）的TIL，并進行基于七個不同的已知抗腫瘤活性的多官能的效應(yīng)器功能分析，為了確定相關(guān)的T細(xì)胞亞群的反應(yīng)病人自身的變異性。 為了確定表達(dá)T細(xì)胞功能的相對定量的能力，我們比較了腫瘤反應(yīng)性細(xì)胞的MFI。利用CD4 +和CD8 + T細(xì)胞的嚴(yán)格的選通策略，僅通過有反應(yīng)的T 細(xì)胞（T 細(xì)胞反應(yīng)陽性）對腫瘤活性的細(xì)胞進行鑒定。 圖3: 對黑素瘤CD4 +和CD8 + T細(xì)胞應(yīng)答的多官能表征。A. 來自腫瘤反應(yīng)性CD4 +和CD8 + T細(xì)胞七個個體 T細(xì)胞的功能的表達(dá)的半定量比較，對于任何單獨的T細(xì)胞的功能，在條形圖顯示出相對表達(dá)值用下述式得到：100 / [（全部CD4 + T細(xì)胞表達(dá)的刺激樣品中的單個功能的MFI /未刺激的CD4 + T細(xì)胞的MFI） /（全部CD8 + T細(xì)胞表達(dá)的各個功能的刺激樣品中的MFI /未刺激的CD8 + T細(xì)胞的MFI）。值超過1，所述個體的T細(xì)胞的功能主要是由CD8 + T細(xì)胞表達(dá)（例如，在細(xì)胞因子的情況下，產(chǎn)生細(xì)胞因子的單細(xì)胞水平CD8 + T細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子比產(chǎn)生細(xì)胞因子的CD4 + T細(xì)胞更多）。 值低于1的，所述個體的T細(xì)胞的功能主要由CD4 + T細(xì)胞表達(dá)。 B，CD4或CD8 T細(xì)胞亞群的細(xì)胞依據(jù)表達(dá)的分析七T細(xì)胞功能中的至少一個進行門控，和細(xì)胞表達(dá)的任何的七個細(xì)胞功能的頻率進行了評估。圖表明，絕大多數(shù)的腫瘤響應(yīng)的CD4 + T細(xì)胞（即，表達(dá)的7種 T細(xì)胞功能中的至少一種）也產(chǎn)生TNF。柱表示平均值誤差線。 C和D，SPICE的T細(xì)胞的功能分析細(xì)胞表達(dá)的7 種T細(xì)胞功能中的至少一個的分析表明CD4 +和CD8 + T細(xì)胞非常不同的功能模式。 ＃，P <0.05。 這些分析顯示了在單個細(xì)胞的基礎(chǔ)上， CD4 + T細(xì)胞能更多產(chǎn)生TNF（補充圖S3）和IL2的固有能力，但是相對于IFNγ，MIP-1α和MIP-1β的生產(chǎn)（圖3A）的。另一方面，從僅1例CD4 + T細(xì)胞群中檢測到IL17A產(chǎn)生，CD8 + T細(xì)胞中沒有，而CD107a動員與CD8 + T細(xì)胞活性（圖3A）更加相關(guān)聯(lián)。概括地說，單個產(chǎn)生TNF的 CD4 + T細(xì)胞平均產(chǎn)生的TNF，比單個產(chǎn)生TNF CD8 + T細(xì)胞得多。IL2的生產(chǎn)量也類似，但如預(yù)期的， CD107a動員的結(jié)果與之相反。 隨后，至少產(chǎn)生七個T細(xì)胞功能中一種的細(xì)胞的相對比例的選擇性分析顯示CD4 + T細(xì)胞向產(chǎn)生陽性腫瘤壞死因子（TNF）（圖3B）顯著歪斜。的確，85％C的至少產(chǎn)生一種D4 + T細(xì)胞功能的細(xì)胞都表達(dá)出TNF生產(chǎn)。因此， TNF的產(chǎn)生似乎是CD4 + T細(xì)胞必須滿足的一個必要條件，以對黑素瘤產(chǎn)生直接響應(yīng)。這與過去在相同的TIL產(chǎn)品中被觀察到的CD8 + T細(xì)胞有很大不同，只有約50％的應(yīng)答細(xì)胞產(chǎn)生陽性腫瘤壞死因子TNF（圖3B）。其他T細(xì)胞的功能，除了CD8 + T細(xì)胞IFNγ生產(chǎn)（僅觀察到趨勢），反映了定量表達(dá)評估的結(jié)果。的確，我們觀察到MIP-1A-和MIP-1b產(chǎn)生細(xì)胞的相似頻率，CD4 + T細(xì)胞表達(dá)IL-2的比例略高，但十分顯著的是，更多CD8 + T細(xì)胞動員CD107a（圖3B）。在全球范圍內(nèi)，這些結(jié)果表明，無論CD4 + T細(xì)胞表達(dá)哪種功能，TNF的產(chǎn)生似乎是普遍的。 SPICE（Simplified Presentation of Incredibly Complex Evaluations）是一種新型的生物信息學(xué)工具，通過組合布爾門控和復(fù)雜算法的數(shù)據(jù)分析（20，23），允許在眾多不同的細(xì)胞群（未被經(jīng)典順序選通策略證明）中T細(xì)胞效應(yīng)子功能的多樣“模式”的深度檢測，。為此目的，我們已經(jīng)利用SPICE T細(xì)胞應(yīng)答的質(zhì)量監(jiān)督進行了樣品分析。 復(fù)雜功能模式分析表明擴增CD4 +和CD8 + T細(xì)胞對自體黑色素瘤的反應(yīng)之間有強烈的病人自身差異（P = 0.0006）。再次確認(rèn)了CD4 + T細(xì)胞顯著向TNF生產(chǎn)傾斜，特別是超過50％產(chǎn)生可檢測的響應(yīng)的CD4 + T細(xì)胞的僅產(chǎn)生TNF，而CD8 + T細(xì)胞的反應(yīng)出現(xiàn)更復(fù)雜，多功能，且大多是基于IFNγ生產(chǎn)或CD107a動員（圖3C和D）。補充圖S4表示SPICE數(shù)據(jù)分析的圖形，以條形圖表示的T細(xì)胞功能（n=128）中的所有可能的組合（補充圖S4A），CD4 +的（補充圖S4B），或CD8 +（補充圖S4C）T細(xì)胞的NPLot或CoolPlot（補充圖S4D） 由于技術(shù)的復(fù)雜性和所需的描述的實驗大量TIL樣品的可用性，擴增的TIL如前面所說被用于實驗。然而，我們不知道在幾次對數(shù)擴增中觀察到的功能的模式被是否保持。因此，我們進行了最小擴增的TIL以及未培養(yǎng)的TIL類似分析，和與來自相同的病人的擴增TIL的結(jié)果比較。我們進行了7種T細(xì)胞的功能的實驗，但如具有擴增的TIL，只有少數(shù)的T細(xì)胞表達(dá)IL2，IL17A，MIP-1α，或MIP-1β（數(shù)據(jù)未顯示）。因此，只分析了三個功能（TNF，IFNG，和CD107a）。 記住在未培養(yǎng)的TIL的分析中潛在的技術(shù)缺陷（參見材料和方法/統(tǒng)計分析），該分析顯示出所有TIL分析中觀察到的類似模式。密切的相似性與以往擴增的TIL多功能結(jié)果。實際上，當(dāng)在每個類型的TIL培養(yǎng)物中CD8 + T與CD4 + T細(xì)胞亞群相比較時，觀察到在CD4 + T細(xì)胞中TNF產(chǎn)生細(xì)胞的比例較高（補充圖S5A）。此外，CD4 + T細(xì)胞和CD8 + T細(xì)胞的模式是不同類型的TIL培養(yǎng)的（補充圖S5A和S5B），補充圖S6顯示了每個單獨患者T細(xì)胞功能模式，再次示出不同類型的TIL culture之間密切的病人自身相似之處. 這樣，我們的結(jié)論是，在體外在擴增的TIL中觀察的CD4 +和CD8 + T細(xì)胞亞群之間的主要功能差異在體內(nèi)擴增時是穩(wěn)定的，從而反映在腫瘤微環(huán)境的T細(xì)胞反應(yīng)。 在一個不同的說明，似乎比例較高CD107a細(xì)胞隨著IFNg細(xì)胞的比例較低存在于未培養(yǎng)TIL（補充圖S5A和S5B）。然而，考慮到進行分析的患者數(shù)少，以及在未培養(yǎng)的TIL的分析技術(shù)問題（參見材料和方法/統(tǒng)計分析），這偶然觀察到的事件需要進一步的調(diào)查，但它不改變整體的結(jié)論，即CD4 + T細(xì)胞產(chǎn)生更多的腫瘤壞死因子，未培養(yǎng)的TIL也相同。 TNF對CD8 + T細(xì)胞識別的影響 因為我們的數(shù)據(jù)表明，腫瘤壞死因子的產(chǎn)量為黑素瘤特異性CD4 + T細(xì)胞的主要效應(yīng)器功能，所以我們想知道自身黑素瘤暴露于TNF是否可以影響被擴增的CD8 TIL所識別。為此，用TNF，IFNG，或兩者TNF和IFNG同時處理黑素瘤細(xì)胞。為了再現(xiàn)一個具有較強的CD4 + T細(xì)胞應(yīng)答，CD8 + T細(xì)胞應(yīng)答或兩者的腫瘤微環(huán)境，在先前的SPICE分析的基礎(chǔ)上這個被選擇。 圖4: 細(xì)胞因子對腫瘤識別的CD4 +和CD8 +腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞的影響。 A，腫瘤壞死因子減少腫瘤的識別MART-1特異性CD8 +腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞沒有顯著改變腫瘤識別其他特定的CD8 +腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞。 FACS圖細(xì)胞因子表達(dá)從三個具有相似結(jié)果測試的代表性患者示于該圖。 B，暴露于IFNγ，TNF或TNF和IFNG同時對腫瘤的識別大量CD8 +腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞的影響。線顯示CD8 +的TIL的頻率同時表達(dá)TNF，IFNγ，和CD107a中的至少兩個功能的平均值。 C和D，IFNγ，TNF或TNF及IFNγ對腫瘤識別大量CD4 +的TIL同時暴露的影響。線顯示平均值，P <0.05，P <0.01。 蘭茨貝格和他的同事（24）先前已經(jīng)證明，腫瘤壞死因子誘導(dǎo)黑素瘤可逆去分化并減少了T細(xì)胞識別黑色素瘤分化抗原（MDA）。T細(xì)胞應(yīng)答的分析顯示，如預(yù)期，腫瘤壞死因子顯著降低MDAs的識別（圖4A和補充圖的S7-數(shù)字代表不同患者，實驗使用來自三個不同患者樣品并獲得類似的結(jié)果；數(shù)據(jù)未示出）。然而，TNF沒有顯著影響球型CD8 + T細(xì)胞的反應(yīng)性（圖4A和B）。正如所料，IFNγ并不顯著增加球型CD8 +和CD4 + T細(xì)胞的反應(yīng)性（圖4B-D和補充圖S8），如先前由我們的組（10）所證明的。值得注意的是，它也同樣被證明，IFNγ既不增加也不減少由MDA-特定細(xì)胞進行的自體或異體腫瘤識別，如CD8 + T細(xì)胞識別MART-1EAA或GP-100YLE肽（10） - 盡管在這種情況下，因為IFNγ誘導(dǎo)從蛋白酶到免疫蛋白酶轉(zhuǎn)變（25，26），所以仍然未完全闡明，這種影響是否是抗原類特定的或肽特異性，。 令人驚奇的是，暴露于TNF顯著降低IFNγ介導(dǎo)的CD8 + T對黑素瘤細(xì)胞反應(yīng)的增加（圖4B和補充圖S8）。另一方面，TNF與未經(jīng)處理的腫瘤（圖4C和D）相比能增加（盡管不是顯著）CD4 + T細(xì)胞應(yīng)答。 這些數(shù)據(jù)表明，一方面TNF趨于依照正反饋機制略微擴增本身（暴露于TNF的腫瘤增加從CD4 + T細(xì)胞的TNF產(chǎn)生），但在另一方面，它抑制了在IFNγ富腫瘤微環(huán)境中CD8 + T細(xì)胞的反應(yīng)性，并且這種抑制與強CD8 + T細(xì)胞反應(yīng)的存在同時發(fā)生。 TIL對黑色素瘤細(xì)胞基因表達(dá)的影響 為了闡明所觀察到對CD8 + T細(xì)胞對腫瘤識別的影響是否與基因表達(dá)相關(guān)聯(lián)，對與免疫識別有關(guān)的一組基因通過qPCR在八個細(xì)胞系中進行分析（來自Pt. 1，5，11，13，15 ，17，18，和19）。除了眾所周知的IFNγ對免疫抑制基因表達(dá)的有增加影響，也能提高TNF提高表達(dá)基因的表達(dá)，例如吲哚胺2,3雙加氧酶-1（IDO-1）或程序??性死亡配體 - 1（PD-L1）約5至10倍（補充圖S9A）。此外，MDAs的表達(dá)下降趨勢被證實（補充圖S9B）。另一方面，在加入TNF到2至5倍觀察到MHC I類處理和呈遞途徑的表達(dá)趨勢傾向增加，但尤其是IFNγ本身相對于對照組表達(dá)增加約10 f倍（補充圖S9C）。 這些數(shù)據(jù)可能表明，在IFNγ富含腫瘤微環(huán)境中，腫瘤壞死因子通過對腫瘤細(xì)胞的免疫能力的增強降低黑素瘤免疫敏感性。 圖5: 腫瘤響應(yīng)CD4 + T細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞或CD8 IFNγ應(yīng)答的影響。A，來自對自體增殖的黑色素瘤細(xì)胞高CD4 + T細(xì)胞應(yīng)答的患者的活化CD4 + T細(xì)胞的上清液的的影響。點為有誤差棒的平均值。 B，來自高CD4 + T細(xì)胞應(yīng)答患者的CD8 +或CD4 +腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞的自體腫瘤細(xì)胞毒性。 CD4 + T細(xì)胞培養(yǎng)物中顯示灰色，CD8 + T細(xì)胞以黑色顯示。 C和D，分選后的 CD8 +，CD4 +或CD8 +和CD4 +合并的TIL的IFNG ELISPOT分析。 C和D，從個別患者的結(jié)果（平均一式三份的觀察及誤差棒的; C）中，而D顯示來自一個有代表性的患者的ELISPOT孔中。 瘤特異性CD4 + T細(xì)胞對黑色素瘤細(xì)胞的增殖和生存力或?qū)Χ唐诘腃D8 IFNγ反應(yīng)的腫的影響 為了表征CD4 + T細(xì)胞應(yīng)答是否會影響黑色素瘤細(xì)胞的增殖或存活，我們進行了附加的增殖和細(xì)胞毒性實驗。 自體腫瘤與來自6例上述（與自體腫瘤同時激活）的高水平CD4 + T細(xì)胞反應(yīng)性（Pts.1，5，11，15，18，和19）患者的分好類的CD4 + T細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液培養(yǎng)72小時，并如前述以標(biāo)準(zhǔn)流式細(xì)胞術(shù)為基礎(chǔ)的計數(shù)測定細(xì)胞增殖（10）。只有2個6黑色素瘤細(xì)胞系中有意義的CD4 + T細(xì)胞的上清液增殖（圖5A）是明顯的。 CD4 + T細(xì)胞對黑色素瘤的直接細(xì)胞毒活性已在先前小鼠實驗中證明。為了評估是否腫瘤細(xì)胞毒性CD4 + T細(xì)胞可在人類中被檢測到，對分類后的CD4 +或CD8 + T細(xì)胞來自5名高CD4 + T細(xì)胞反應(yīng)患者（Pts. 1，5，11，15，和19）進行標(biāo)準(zhǔn)的4小時的細(xì)胞毒性實驗。在4/5的案例中CD8 + T細(xì)胞顯示殺死自體腫瘤的能力，而CD4 + T細(xì)胞在任何情況下沒有顯示出（圖5B）。 這些結(jié)果表明，在免疫應(yīng)答的效應(yīng)階段CD4 + T細(xì)胞反應(yīng)似乎不具有直接強烈的抗腫瘤活性。 評估CD4 +和CD8 + T細(xì)胞生產(chǎn)IFNγ是否其他細(xì)胞亞群的存在的影響和/或CD4 + T細(xì)胞的存在是否可以增強的CD8應(yīng)答，進行來自6個高CD4 + T細(xì)胞的反應(yīng)性患者（Pts.1，5，11，15，18，和19）的CD8 + T細(xì)胞加入CD4 +，CD8 +或CD4 +和CD8 +一起的ELISPOT分析。添加兩種細(xì)胞亞群獲得IFNγ特定斑點的數(shù)目與單獨的任一CD4 +或CD8 + T細(xì)胞獲得的斑點數(shù)的平均值是大概一致的，和沒有觀察到增加效應(yīng)（圖5C和D）。因此，我們的結(jié)論是，在短期測定法中關(guān)于腫瘤識別和相對IFNγ生產(chǎn)CD4 +和CD8 + T細(xì)胞似乎不相互作用或影響彼此。 組成型和高CD4 + T細(xì)胞反應(yīng)患者的結(jié)果 最后，我們試圖評估在擴增的TIL是否高CD4 + T細(xì)胞應(yīng)答，組成型II類陽性，或高CD4 /的CD8 T細(xì)胞比率（后者具有較多病例）的存在與已知的黑色素瘤或患者的生存預(yù)后相關(guān)聯(lián)因素。血漿乳酸脫氫酶（LDH）被選擇用于實驗，因為它目前代表在轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的最準(zhǔn)確的預(yù)后循環(huán)標(biāo)記物的。 并沒有觀察到血漿LDH水平巨大差異（補充圖S10A和S10E），除了在較高的LDH值、無MHC II類組成腫瘤患者（補充圖S10C）。在患者組（補充圖S10B，S10D，與S10F）之間，總生存期無顯著差異。同時考慮到數(shù)量相對較少的患者，這些數(shù)據(jù)表明，檢查的因素不是黑色素瘤強有力的獨立的預(yù)后指標(biāo)。 討論 有在人類轉(zhuǎn)移性黑素瘤中由CD4 + T細(xì)胞應(yīng)答介導(dǎo)的腫瘤消退軼事的病例被報告（8，9，27）。然而，很少有人知道在腫瘤微環(huán)境，如何生成天然效應(yīng)子CD4 + T細(xì)胞應(yīng)答，CD4 + T細(xì)胞是如何影響CD8 + T細(xì)胞反應(yīng)。 MHC II類的組成型表達(dá)通常僅限于專業(yè)抗原提呈細(xì)胞（APC;參考28）。然而，以往的研究表明，MHC II類的黑色素瘤的組成型表達(dá)通過II類反式（CIITA）的異常轉(zhuǎn)錄可能不是一個隨機事件，而是與惡性轉(zhuǎn)化有關(guān)（29）。 CIITA活化本身并沒有參與腫瘤發(fā)展（30），這表明它的異常誘導(dǎo)是靠一個依賴于MHC II類表達(dá)的更復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)發(fā)起和維持。 在這項研究中，我們已經(jīng)表明，盡管不是必要的或足夠的，在黑色素瘤細(xì)胞MHC II類的從頭組成型表達(dá)是一個功能強大的刺激，以促進腫瘤特異性CD4 + T細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境的積累。我們的數(shù)據(jù)表明，據(jù)推測，局部黑素瘤已經(jīng)發(fā)生在早期階段。 CD4 + T細(xì)胞直接識別黑素瘤的表面上呈現(xiàn)相關(guān)聯(lián)地MHC II類分子的腫瘤抗原，并執(zhí)行由TNF產(chǎn)生支配效應(yīng)子功能。事實上，內(nèi)源性蛋白可以通過自噬和/或非經(jīng)典的抗原加工（31，32）被呈現(xiàn)在II類。 我們已經(jīng)表明，通過腫瘤特異性CD4 + T細(xì)胞產(chǎn)生的效應(yīng)子功能不顯著影響黑素瘤增殖或生存力，與CD8 + T細(xì)胞的同時有效的細(xì)胞毒性。這意味著，細(xì)胞擴增的標(biāo)準(zhǔn)條件下，至少在大多數(shù)情況下，腫瘤特異性CD4 + T細(xì)胞的直接的抗腫瘤活性不是很有效地限制黑素瘤的體外生。這可能反映了體內(nèi)大多數(shù)腫瘤特異性CD4 + T細(xì)胞這個條件是不能夠介導(dǎo)直接的有力的抗腫瘤作用。 以前的研究表明黑素瘤腫瘤的長期暴露于TNF的有害作用。蘭茨貝格和他的同事（24）已經(jīng)表明，以下的TNF-豐富的炎性環(huán)境可以降低免疫原性和通過誘導(dǎo)可逆的去分化促進黑色素的免疫逃逸。在這項研究中，我們已經(jīng)證實，黑色素瘤在局部的TNF的慢性暴露下調(diào)MDA-特異性CD8 + T細(xì)胞的識別。然而，使用批量TIL培養(yǎng)的時候，非常有趣的是，暴露前腫瘤壞死因子并沒有顯著影響CD8 + T細(xì)胞反應(yīng)。這可能表明，MDA??特異性T細(xì)胞對總CD8 + T細(xì)胞反應(yīng)性的貢獻比較小。 與此相反，暴露于TNF能顯著降低眾所周知IFNγ介導(dǎo)增加的CD8 + T細(xì)胞反應(yīng)對黑素瘤的。這表明，在一個IFNγ豐富的環(huán)境，例如含IFNγ產(chǎn)生CD8 + T細(xì)胞的腫瘤微環(huán)境，來自腫瘤特異性CD4 + T細(xì)胞（或其他來源）的TNF可能降低CD8 + T細(xì)胞的反應(yīng)性，并通過正反饋的T細(xì)胞反應(yīng)同步增加CD4 +，從而擴增本地TNF信號。 嘗試表征導(dǎo)致所觀察到的現(xiàn)象的分子事件，我們分析一組能夠通過影響對黑素瘤免疫敏感性的基因的表達(dá)。雖然IDO-1和PD-L1的誘導(dǎo)證明了進一步增加腫瘤細(xì)胞的免疫抑制能力，并且TNF的加入降低MDA基因的表達(dá)，與MHC I類抗原加工和呈遞途徑相關(guān)聯(lián)的其他基因似乎也被誘導(dǎo)。盡管困難量化不同免疫活化/免疫抑制途徑的相對貢獻，腫瘤細(xì)胞的增加的免疫抑制能力可能解釋了在實驗中觀察到的免疫靈敏度減少。 有趣的是，這些數(shù)據(jù)支持一個腫瘤進展模型: 為了逃避有效的CD8 + T細(xì)胞反應(yīng)，一些黑色素瘤激活CIITA因此組成型表達(dá)MHC II類。反過來在腫瘤微環(huán)境募集了通過TNF的產(chǎn)生抑制CD8 + T細(xì)胞應(yīng)答的腫瘤特異性CD4 + T細(xì)胞。 值得注意的是，MHC II類與其他腫瘤相關(guān)的免疫抑制分子有幾個共同的特點，例如，氧酶和PD-L1上。事實上，如本和幾個其他研究中，MHC II類的異常在某些黑素瘤被激活，并完全和IDO和PD-L1相同（33，34），它是由IFNγ介導(dǎo)的免疫應(yīng)答上調(diào)的。因此，在黑色素瘤原位檢測的MHC II類的可表示在黑色素瘤細(xì)胞組成型表達(dá)或被誘導(dǎo)IFNγ分泌細(xì)胞（例如，腫瘤抗原特異性CD8 + T細(xì)胞），或兩者??的存在。 迄今許多其它逃避CD8 + T細(xì)胞應(yīng)答的機制已被表征（35）。 CD8 + T細(xì)胞識別與MHC I類分子表達(dá)的腫瘤細(xì)胞的表面上的相關(guān)聯(lián)的腫瘤抗原。因此，在I類抗原加工和呈遞途徑的缺陷，以及I類MHC分子下調(diào)可能本身抑制CD8 + T細(xì)胞應(yīng)答。事實上，幾個研究已經(jīng)證明，I類分子表達(dá)的下調(diào)與幾種預(yù)后較差的實體腫瘤相關(guān)聯(lián)，包括黑色素瘤（5）。 有趣的是，在這項研究中的那些未吸引強CD4 + T細(xì)胞應(yīng)答的黑素瘤響應(yīng)于IFNγ顯示MHC I類的一個有缺陷的上調(diào)。這確實可能被解釋為額外的免疫逃逸機制，從而暗示腫瘤兩個不同亞群的存在：（i）高CD4 + T細(xì)胞應(yīng)答（在大多數(shù)情況下，由第II類的從頭組成性表達(dá)引起）和正常 I類黑素瘤接觸IFNγ后上調(diào); （ⅱ）有響應(yīng)于IFNγ缺陷的I類上調(diào)的黑素瘤不吸引強CD4 + T細(xì)胞應(yīng)答。根據(jù)這個模型，二者黑素瘤答要么間接地通過炎性CD4 + T細(xì)胞的吸引力（黑素瘤亞群i）中，或直接通過I類MHC（黑素瘤亞群ⅱ）的有缺陷的上調(diào)有效地下調(diào)CD8 + T細(xì)胞應(yīng)。 作為這一理論的間接確認(rèn)，強CD4 + T細(xì)胞應(yīng)答（或具有組成型MH C II類陽性的腫瘤）患者似乎沒有比無CD4 + T細(xì)胞反應(yīng)的患者具有更差的預(yù)后。后者表達(dá)一個普遍有缺陷的上調(diào)的MHC I類分子。 在我們的研究中，絕大多數(shù)病人（85％）被確診為AJCCⅣ期黑色素瘤（向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移）。然而，我們發(fā)現(xiàn)強烈的CD4 + T細(xì)胞反應(yīng)在有3/6例早期疾病階段（IIIB / IIIC）。如由最近的一項研究（36），在執(zhí)行及時完整切除局部黑色素瘤的情況下，局部免疫反應(yīng)的影響則與臨床結(jié)果無關(guān)。相比之下腫瘤固有特征可能決定了患者是否很快會向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。因此，更可能的是我們的觀察可以被應(yīng)用到完全切除是不可行的疾病階段。 應(yīng)當(dāng)強調(diào)的是，盡管CD4 + T細(xì)胞天然對黑素瘤原位的響應(yīng)和相關(guān)慢性暴露于TNF可以減少在大多數(shù)情況下（即，大多數(shù)腫瘤特異性CD4 + T細(xì)胞）的抗腫瘤CD8 + T細(xì)胞反應(yīng)，如最近由Tran和他的同事（37）在膽管癌中（即，多官能性突變的抗原特異性CD4 + T細(xì)胞）或由以前單一的病例報告（9，27），這不排除選擇CD4 + T細(xì)胞亞群的潛在有益作用，或者利用這些應(yīng)答原理的治療的可能性的。關(guān)于這一點，最近，Linnemann和他的同事（11）在黑色素瘤發(fā)現(xiàn)特征變異（新 - ）抗原特異性CD4 + T細(xì)胞。在他們的研究中，作者描述了在4/5例患者（相對）小的CD4 + T細(xì)胞亞群在接觸新抗原后產(chǎn)生IFNγ，而不是其他細(xì)胞因子。這是特別有趣的，因為我們的數(shù)據(jù)顯示，黑色素瘤中腫瘤特異性CD4 + T細(xì)胞絕大多數(shù)產(chǎn)生TNF和而不是IFNγ，也表明黑素瘤特異性CD4 + T細(xì)胞的一個非常小的亞群只產(chǎn)生IFNγ（圖3C和D）。無論如何這難以得出確切的結(jié)論，因為Linnemann和他的同事的大多數(shù)的T細(xì)胞識別分析（11），使用自體B細(xì)胞（呈新抗原）為靶，而不是腫瘤細(xì)胞。確實以前的研究得出，一些因素可能影響T細(xì)胞的功能，包括抗原密度（38，39）可能在肽負(fù)載的APC和腫瘤細(xì)胞不同。未來的研究將確定功能差異是否在不同的類腫瘤抗原的CD4 + T細(xì)胞亞群之間存在。 此外，腫瘤抗原特異性CD4 + T細(xì)胞的作用當(dāng)然不限于直接識別的腫瘤細(xì)胞。例如，腫瘤抗原特異性CD4 + T細(xì)胞通過可抗原呈遞細(xì)胞（40）的CD40的配體介導(dǎo)的激活促進腫瘤抗原特異性CD8 + T細(xì)胞的交叉激活的。最近，出乎意料的是，在三個獨立的小鼠模型結(jié)果表明，大部分的免疫原性mutanome是由CD4 + T細(xì)胞識別（41）。如果由CD4 + T細(xì)胞識別的腫瘤抗原的是癌癥如此普遍，可以推測，在腫瘤進展，癌細(xì)胞利用（或至少不影響）這些免疫系統(tǒng)的特征成形。我們的結(jié)果表明，這可能通過局部條件的產(chǎn)生（例如，MHC II類的異常表達(dá)）來實現(xiàn)誘導(dǎo)例如CD4 + T細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境積聚來支持，而不是抑制，腫瘤的生長。 總之，免疫逃逸的幾個機制已經(jīng)確定，在臨床上這些戰(zhàn)略在抵消腫瘤免疫抑制表現(xiàn)出不俗的成績（42-45）。在這項研究中，我們已經(jīng)確定了黑色素瘤中從頭MHC II類上的異常表達(dá)可通過招募炎癥腫瘤抗原特異性CD4 + T細(xì)胞對腫瘤逃逸起作用的潛在機制。然而，在起始和維持的免疫反應(yīng)中的MHC II類分子的基本作用不會立即保證策略直接抵消這一途徑，未來的研究會解決這個問題。