動物墊料中綠膿桿菌檢測方法 編制說明 2019.12.20

《動物墊料中綠膿桿菌檢測方法 編制說明 2019.12.20》由會員分享，可在線閱讀，更多相關《動物墊料中綠膿桿菌檢測方法 編制說明 2019.12.20（10頁珍藏版）》請在裝配圖網上搜索。

DB15/T XXXXX—XXXX 編制說明 項目名稱：動物墊料中綠膿桿菌檢測 項目編號：內質監(jiān)標函（2018）154號-106 編制單位：呼和浩特海關 編制時間：2018.05-2019.10 一、 工作簡況 本標準根據《關于下達2018年第一批內蒙古自治區(qū)地方標準制修訂項目計劃的通知》[內質監(jiān)標函（2018）154號]，本標準是由中華人民共和國呼和浩特海關提出并歸口，項目計劃編號為106。呼和浩特海關牽頭成立由相關領域的專業(yè)技術人員和具有標準化專業(yè)知識的人員組成的標準起草組。起草組在充分調查研究、綜合分析和試驗驗證的基礎上，起草標準初稿和編制說明，并廣泛征求意見。對意見進行匯總整理，修改完善標準初稿，形成地方標準征求意見稿。 第一起草單位：中華人民共和國呼和浩特海關；第二起草單位：二連浩特海關；第三起草單位：二連浩特市疾病預防控制中心。本標準主要起草人：趙治國、敖威華、楊帆、延涵、王海艷、陳林軍、崔強、韓祎陟、郭文麗、馬彩霞。 二、標準制定的背景及意義 動物墊料與動物關系密切。近年來隨著生物科學研究的飛速發(fā)展，動物作為其研究中不可缺少的重要組成部分，備受各國政府的重視和科學家的關注。墊料是為動物營造舒適的人工環(huán)境，進行環(huán)境控制的基礎條件和必要材料，是對動物產生直接作用和影響的環(huán)境因素。動物墊料與動物健康、福利息息相關，同時也對養(yǎng)殖業(yè)、動物及其相關科研方面甚至社會經濟發(fā)展有十分重大的影響。因此，墊料的質量評定與控制非常必要。 我國動物墊料標準化、商品化尚處于初級階段。歐美等發(fā)達國家早已實行墊料商品化生產，有專業(yè)的工廠，并且各道工序的質量要求非常嚴格。但我國對動物墊料的研究還處于初級階段，與墊料相關的文獻報道甚少，墊料生產監(jiān)管環(huán)節(jié)薄弱，檢測標準缺乏。近年來我國政府及從業(yè)人員逐漸認識到動物墊料中存在的問題，開始對墊料質量評價方面的問題進行改進。因此要想使動物的質量管理與國際接軌，動物墊料生產的標準化、商品化就變得至關重要。 我國動物墊料標準化和質量管理相對滯后，影響相關行業(yè)發(fā)展。我國對動物墊料的研究才剛剛起步，現(xiàn)行的國家標準和實驗動物相關管理條例中，對動物墊料的標準化規(guī)定幾乎空白，稀數(shù)資料對于墊料的規(guī)定只有：應選用吸濕性好、塵埃少、無異味、無毒性、無油脂的材料；須經消毒、滅菌后方可使用。如此籠統(tǒng)的規(guī)定在一定程度上制約了我國動物墊料標準不能緊跟國際標準，同時限制了藥品、生物制品、動物等產品的出口，還使科研論文將不能被同行接受。因此要想提高相關學科競爭力，就必須加強墊料標準化和質量管理，從動物墊料微生物指標監(jiān)測入手。 我國動物墊料微生物檢測標準幾乎空白，亟待建立相關標準。近年來，我國政府及從業(yè)人員逐漸認識到動物墊料對動物健康及下游產業(yè)的重大意義，墊料相關研究報道逐年增多，積累了一定的理論基礎。但目前，我國尚未對國內墊料質量建立統(tǒng)一評價體系、風險分析、國家標準及配套法規(guī)。其中，墊料中微生物特別是致病微生物的含量對動物健康、福利和產品等影響重大，但目前動物墊料中微生物檢測標準屬于空白，亟待建立科學完善的動物墊料微生物檢測標準，該工作將對國內墊料建立統(tǒng)一質量評價體系、風險分析及產品標準等有力促進。 動物墊料中綠膿桿菌對動物的危害極大。動物墊料綠膿桿菌是影響動物健康和動物實驗結果的國際公認的重要環(huán)境因素之一，因此動物墊料中綠膿桿菌的檢測十分重要。綠膿桿菌是人獸共患的一種條件性病原菌。在自然界分布極廣,是多種家畜、經濟動物以及野生動物和人都可感染的一種傳染病，對人畜危害嚴重。病畜及帶菌動物是主要傳染源，經消化道、呼吸道及傷口感染。是燒傷、外傷和術后感染的主要病原菌, 綠膿桿菌感染可發(fā)生在人體任何部位和組織、常見于燒傷或創(chuàng)傷部位、中耳、角膜、尿道和呼吸道。也可引起心內膜炎、胃腸炎、膿胸甚至敗血癥。綠膿桿菌經常由傷口、燒傷部位、外科手術或治療、檢驗用各種插管，甚至使用不當?shù)碾[形眼鏡，而侵入人體。一旦綠膿桿菌侵入患者組織或血液后，常出現(xiàn)各種不同的臨床癥狀，如急性眼內炎；或在囊狀纖維瘤患者身上，出現(xiàn)慢性呼吸道感染，進而演變成慢性肺炎；在免疫力缺失的癌癥患者或嚴重的燒傷病人身上，則出現(xiàn)急性的肺炎或菌毒血癥。院內感染綠膿桿菌所引起的肺炎或菌毒血癥，致死率更高達70％，其中主要的致病因子是綠膿桿菌外毒素Ａ。據報道10％在醫(yī)院感染的病癥都是由綠膿桿菌所引致的，居病原菌之首。國內外燒傷中心對細菌感染的臨床調查中發(fā)現(xiàn)綠膿桿菌感染占50％以上。基于以上致病性，綠膿桿菌是疾病診斷中必檢微生物之一。禽類感染可呈現(xiàn)卡他性或出血性腸炎,或發(fā)生眼角膜炎。也可與葡萄球菌等混合感染呈現(xiàn)呼吸道疾病。綠膿桿菌也是奶牛乳房炎的重要病原菌之一。它引起的疾病不論在發(fā)達國家還是在發(fā)展中國家都嚴重地損害著動物及人類的健康，也給養(yǎng)殖業(yè)造成了重大經濟損失。綠膿桿菌病的危害如此之大，使用綠膿桿菌污染的墊料容易引起動物發(fā)病，含有綠膿桿菌的動物產品又會導致公共衛(wèi)生事件的發(fā)生。動物體內排出的綠膿桿菌，也可能污染食物導致人的食物中毒。因此檢測墊料中綠膿桿菌成為重中之重。 建立動物墊料綠膿桿菌檢測標準，保障動物健康急不可待。動物墊料與動物糞便直接接觸，容易滋生細菌，尤其是腸道致病微生物，致使墊料被綠膿桿菌污染，從而威脅動物的健康與福利，并且對養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展與國際間動物及產品貿易帶來巨大的影響，甚至威脅到人類社會的生產與生活。但是對于動物墊料綠膿桿菌檢測標準幾乎空白，還沒有統(tǒng)一的標準和方法，所以建立動物墊料綠膿桿菌檢測標準已刻不容緩。 本實驗室具有多年微生物檢測的經驗，本方法的開發(fā)和應用，在檢測技術方面填補我區(qū)的空白、彌補了自治區(qū)沒有現(xiàn)行標準的不足，能夠使動物墊料中綠膿桿菌的檢測更加高效、準確、安全。本方法的開發(fā)和應用將會使我區(qū)在動物墊料中綠膿桿菌的檢測先進性方面達到國內領先水平，為我區(qū)動物墊料質量安全管理部門更快更好的管控提供可靠保障。因此，加強動物墊料中綠膿桿菌的檢測對確保全區(qū)農業(yè)持續(xù)、健康發(fā)展具有重要的現(xiàn)實意義。 三、主要起草過程 2018.05-2018.08 地標前期基礎工作：收集動物墊料樣本，查閱綠膿桿菌資料，檢索綠膿桿菌檢測的相關文獻及標準。 2018.09-2019.07 前期實驗條件的摸索：包括前處理方法的優(yōu)化、對照，不同墊料中綠膿桿菌的檢出率，最終確定實驗方案，編寫編制說明。 2019.08-2019.09 驗證單位進行驗證。 2019.10 編寫地標并定初稿。 四、現(xiàn)行法律、法規(guī)和強制性標準的關系 本標準遵循GB/T 1.1-2009 《標準化工作導則 第1部分：標準的結構和編寫》和GB/T 20001.4-2015 《標準編寫規(guī)則 第4部分：試驗方法標準》的規(guī)則編寫。還參照相關國家標準編寫指南的要求。 在編制本標準的過程中參考了以下標準：ISO 22717:2015 《Cosmetics. Microbiology. Detection of Pseudomonas aeruginosa》、AOAC Official Method 991.49 《Testing Disinfectants Against Pseudomonas aeruginosa》、SN/T 2099《進出口食品中綠膿桿菌檢測方法》、GB 7918.4《化妝品微生物標準檢驗方法 綠膿桿菌》、DB 22/T 394.3-2017《保健用品微生物檢驗方法 第3部分：銅綠假單胞菌測定》、GB 8538-2016《食品安全國家標準 飲用天然礦泉水檢驗方法》、GB/T 14926.17-2001《實驗動物 綠膿桿菌檢驗方法》、SN/T 4458-2016《出口中藥材微生物學檢驗》；綜合參考了國內外與綠膿桿菌檢測相關的檢測標準，力求該標準能夠高效準確的檢測墊料中綠膿桿菌，同時兼顧標準的廣泛應用。 本標準完全符合現(xiàn)行法律法規(guī)和強制性標準規(guī)定，不存在任何與現(xiàn)行法律法規(guī)和強制性標準相違背之處。相關強制性標準2項：GB 14925-2010 《實驗動物 環(huán)境及設施》，本標準規(guī)定了實驗動物及動物實驗設備和環(huán)境的技術要求及檢測方法，同時規(guī)定了墊料、飲水和籠具的原則要求。但針對墊料該標準僅規(guī)定了“墊料的材質應符合動物的健康和福利要求，應滿足吸濕性好、塵埃少、無異味、無毒性、無油脂、耐高溫、耐高壓等條件；墊料必須經滅菌處理后方可使用”，本地標適用于墊料中綠膿桿菌檢測，明確規(guī)定了不同類別墊料取樣方法，標準中綠膿桿菌鑒定過程增加了新的鑒定手段，確保檢測結果更加準確。 5、 主要內容及檢測方法的確定 5.1 取樣方法的確定及優(yōu)化 根據動物墊料的物理性狀將其分為顆粒狀/粉末狀墊料和平面狀墊料，針對不同性狀的墊料采取不同的取樣方法。 5.1.1 顆粒狀或粉末墊料樣品取樣方法 國內外食品和飼料中霉菌檢測法中常用的取樣方法為稱取法，本標準中針對顆粒狀或粉末墊料樣品（木屑、玉米芯、秸稈、紙屑等）參考通用做法采用稱取25 g的方法進行取樣。 5.1.2 平面墊料樣品取樣方法 針對平面墊料（膠墊、托盤等）采用表面涂抹取樣法，無菌操作將涂抹25 cm2～100 cm2平面樣品的棉拭子置入裝有 25 mL～100 mLSCDLP中，混勻作為原液。 5.2 增菌液和培養(yǎng)基的選擇 5.2.1 增菌液的選擇 國內外標準和資料中用到的增菌液主要有：SCDLP液體培養(yǎng)基、NAC液體培養(yǎng)基、滅菌生理鹽水、磷酸鹽緩沖稀釋液和營養(yǎng)肉湯（NB）等。不同標準中使用最多的是SCDLP，本標準也選用該增菌液。 5.2.2 分離培養(yǎng)基 本標準選用的綠膿桿菌分離培養(yǎng)基為國內外標準中比較認可的假單胞菌CFC選擇性培養(yǎng)基、假單胞菌CN選擇性培養(yǎng)基，在保證檢測結果的同時，兼顧不同標準所用培養(yǎng)基的一致性，節(jié)約實驗室成本。 5.3 典型或可疑菌落的鑒定 本標準對典型或可疑菌落的鑒定過程，參考了國內外綠膿桿菌檢測標準和藥典等成熟做法，綜合了生化反應等必要鑒定過程，并囊括了全自動細菌鑒定系統(tǒng)和飛行時間質譜檢測方法，做到了與國際接軌，縮短檢測時間，增加檢測通量，減少檢測人員工作量。 5.4 培養(yǎng)時間和溫度 最新的ISO 22717:2015采用了32.5℃2.5℃的預增菌溫度，使綠膿桿菌培養(yǎng)溫度范圍擴大為為30℃~35℃，而我國常用的綠膿桿菌培養(yǎng)溫度為36℃1℃，也在這一范圍內，本標準將繼續(xù)采用我國常用的36℃1℃對綠膿桿菌進行檢測培養(yǎng)。本標準各種培養(yǎng)基培養(yǎng)時間也與國內外標準常用時間相統(tǒng)一。 六、方法驗證 為驗證本方法的有效性和適用性，選擇5家不同行業(yè)的檢測機構對本方法進行驗證，驗證內容為方法的適用性、準確度、檢出率及相關樣品的檢測，結果顯示該方法穩(wěn)定可靠，符合相關要求。 七、結論 綜上所述，本標準在制定過程中所涉及到的各項技術指標均經過方法學的驗證，并切實可行，完全達到了編制標準的要求。 八、重大意見分歧的處理依據和結果 未發(fā)生。 九、國內外情況簡要說明 國內尚沒有建立統(tǒng)一的國家標準檢測方法。檢索國家標準1項和地方標準2項：GB 14925-2010 《實驗動物 環(huán)境及設施》、江蘇省地方標準DB 32/T 2129-2012 《實驗動物 墊料》、北京市地方標準DB 11/T 1126-2014《實驗動物 墊料》。根據文獻報道尚未發(fā)現(xiàn)內蒙古自治區(qū)內有相關單位從事這項研究。 10、 標準草稿征求意見情況匯總表 序號 意見 提出單位/專家 采納 不采納（說明原因） 1 建議在標準適當位置增加“綠膿桿菌檢測流程圖”。 二連浩特海關技術中心/王伊琴 采納 2 建議將新型“飛行時間質譜法”加入到標準。 包頭海關綜合技術服務中心/張鵬翔 采納 3 建議只保留綠膿菌素、硝酸鹽還原產氣、明膠液化、42℃生長試驗，去掉乙酰胺、葡萄糖酸鹽、精氨酸雙水解酶試驗。 蘭州海關技術中心/張宇霞 采納 4 平面墊料樣品應用表格方式給出采樣量。 貴陽海關綜合技術服務中心/羅阿東 采納 5 無 參考文獻： [1] GB/T 1.1-2009標準化工作導則 第1部分：標準的結構和編寫規(guī)則. [2] GB/T 20001.4-2015標準編寫規(guī)則 第4部分：試驗方法標準. [3] GB 14925-2010實驗動物 環(huán)境及設施. [4] DB 32/T 2129-2012實驗動物 墊料. [5] DB 11/T 1126-2014實驗動物 墊料. [6] SN/T 2099-2008進出口食品中綠膿桿菌檢測方法. [7] GB 7918.4-1987化妝品微生物標準檢驗方法 綠膿桿菌. [8] DB 22/T 394.3-2017.保健用品微生物檢驗方法 第3部分：銅綠假單胞菌測定. [9] GB 8538-2016食品安全國家標準 飲用天然礦泉水檢驗方法. [10] GB/T 14926.17-2001實驗動物 綠膿桿菌檢驗方法. [11] SN/T 4458-2016出口中藥材微生物學檢驗. [12] ISO 22717:2015 Cosmetics. Microbiology. Detection of Pseudomonas aeruginosa. [13] AOAC Official Method 991.49 Testing Disinfectants Against Pseudomonas aeruginosa. 8