結直腸癌中黑色素瘤抗原基因mRNA的表達及意義

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1、結直腸癌中黑色素瘤抗原基因mRNA的表達及意義 【摘要】 目的 檢測結直腸癌組織中黑色素瘤抗原基因mage1、3和4的表達，探討其在結直腸癌免疫治療及作為免疫分子標志物的可行性。方法 采用rtpcr方法，檢測65例結直腸癌組織和相應正常粘膜組織中mage1、3和4的mrna表達，并對pcr擴增產物進行dna測序驗證。結果 65例結直腸癌組織標本中，53.8%（35/65)的患者至少表達一種mage基因。mage1、3、4 mrna表達率分別是18.5%(12/65)、33.9%(22/65)和20%(13/65)，表達任意兩種或以上的mage基因的標本為27.7%(18/65)，

2、而相應正常粘膜組織均未檢測到上述基因的表達。dna測序結果表明rtpcr產物確為目的基因片段。mage基因表達與患者的年齡(除外mage1,p=0.011)、性別、cea、腫瘤大小和位置、組織分化程度、淋巴結轉移、腫瘤浸潤深度及tnm分期無關(p>0.05)。結論 結直腸癌中mage3可作為腫瘤疫苗的備選基因和免疫學檢測的分子標志物，具有作為腫瘤免疫治療特異性靶位的潛在價值，而mage1,4因表達率低限制了其應用價值。 【關鍵詞】 黑色素瘤抗原基因 結直腸腫瘤 mrna表達 黑色素瘤抗原基因（melanoma antigen gene，mage）是首先從黑色素瘤中發(fā)現的一組腫瘤特異

3、性抗原基因，主要表達于以黑色素瘤為主的惡性腫瘤組織中，現已證實在肝、胃、肺等惡性腫瘤中有較高的表達，而在正常組織（除睪丸和胎盤外）不表達[1]，其表達又與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預后關系十分密切。WWw.133229.coM利用這一特點可作為腫瘤免疫治療理想的靶抗原。應用mage基因編碼的抗原肽對黑色素瘤及轉移瘤的腫瘤免疫治療的實驗和臨床研究正在進行，并已取得較好的療效[2,3]。但mage基因在結直腸癌中表達的研究較少且結果不一。為了解mage基因在結直腸癌中的表達特點，我們采用rtpcr方法檢測mage1、3和4在結直腸癌中表達狀況，為研制結直腸癌特異性的腫瘤疫苗及開展以此為靶抗原的免疫治療

4、提供理論依據。 1 材料與方法 1.1 組織標本 65例結直腸癌組織及相應的正常粘膜組織標本，均取自2005年7月～11月在廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院住院手術治療的患者。男44例，女21例；年齡30～80歲，中位年齡55.0歲。其中，高中分化腺癌57例；粘液腺癌3例，復發(fā)2例；低分化癌2例，復發(fā)1例。腫瘤分期和分級根據術后病理結果按最新國際抗癌協(xié)會tnm分期[4]，who標準分級，其中ⅰ期8例，ⅱ期32例，ⅲ期16例，ⅳ9例；有淋巴結轉移18例，無淋巴結轉移47例。所有病例術前均未進行放化療。標本采集：癌組織取癌灶周邊無明顯壞死的腫瘤組織，正常組織取自距病灶10cm以上的正常粘

5、膜，組織大小約1cm1cm1cm。標本在手術切除后10min內放入液氮凍存，后轉入－80℃冰箱保存。標本均經病理組織學檢查證實。睪丸組織用作陽性對照。 1.2 方法 1.2.1 rna提取及逆轉錄 用trizol提取組織總rna，紫外分光光度計測od值，以od260/od280＝1.8～2.0為rna質量判斷標準。逆轉錄反應體系含總rna 3μg，oligo(dt)18 0.5μg，10mmol/ldntp 2μl，rnase抑制劑20u，逆轉錄酶200u，總體積為20μl。逆轉錄完畢后70℃變性10min，冰上冷卻后-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。以上所用器材均為rnase free

6、。gapdh用作內參照。 1.2.2 mage1、mage3和mage4基因的擴增（25μl反應體系） 以1μl cdna為pcr擴增模板，加1.5μl mgcl2，2.5μl 10buffer，1μl dntps ，1μl引物(包括mage、gapdh)，0.2μl taq 酶，16.8μl 滅菌水。各基因的引物[5]及反應條件見表1。反應完成后取5μl pcr產物，進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，少量溴乙錠染色鑒定。于紫外透射儀上觀察電泳結果。采用biorad凝膠圖像分析系統(tǒng)攝片。表1 rtpcr引物序列和反應條件 1.2.3 mage1、mage3和mage

7、4基因擴增產物dna的測序 隨機選取三種mage基因的陽性pcr產物（各3例）進行純化和序列測定。pcr產物純化采用bioflux試劑盒，操作按說明進行。送上海捷瑞生物工程有限公司進行dna測序。 1.2.4 統(tǒng)計學方法 應用統(tǒng)計學軟件spss10.0對數據進行pearson χ2 檢驗或fisher確切概率法檢驗,以p2 結果 2.1 不同mage基因的表達 mage1、3和4三種基因在不同結直腸癌組織標本表達情況見表2。65例結直腸癌組織標本中mage mrna表達頻率最高的是mage3，表達率為33.9%(22/65)，mage1和mage4分別是1

8、8.5%(12/65)和20%(13/65)。內參照gapdh在所有組織標本中均有穩(wěn)定表達，且強度基本一致，證實逆轉錄產物cdna的完整性,見圖1。dna測序證實擴增條帶均為目的基因。所有正常粘膜組織中均未檢測出上述mage基因中任何一種的表達。表2 結直腸癌組織mage1、3和4基因的陽性表達 2.2 mage基因表達與臨床病理特征的關系 三種mage基因的表達與患者年齡(除外mage1，p=0.007)、性別、cea、腫瘤大小和位置、組織分化程度、淋巴結轉移、浸潤深度及tnm分期無關，結果見表3。 2.3 結直腸癌標本中mage基因表達的聚集性 65例癌組織中三

9、種mage基因表達呈不均勻分布，部分癌組織基因表達呈聚集性。53.8%(35/65)的癌癥患者至少表達一種抗原基因，其中mage1、3同時表達為12.3%(8/65)，mage1、4為10.7%(7/65)，mage3、4為9.2%(6/65)，三種同時表達9.2%(6/65)。 2.4 三種mage基因擴增產物dna的測序 dna測序表明三種mage基因的rtpcr產物與genebank數據庫（mage1、3、4基因的登錄號分別為nm_004988.3、nm_005362.3、nm_001011548.1）檢索序列一致，證實所得目的基因的序列正確。 3 討論

10、 mage基因家族位于x染色體上，除睪丸和胎盤組織外，在正常組織中均不表達，但在肝、胃、肺等惡性腫瘤中表達，其編碼的抗原肽可與mhc分子表3 mage基因表達與結直腸癌臨床病理參數間的關系注：*為淋巴結陰性組與陽性組mage表達率比較的p值，#為淋巴結n1組與n2組比較的p值結合遞呈到細胞表面，被t細胞識別，從而激活抗腫瘤免疫應答[1]。因此mage基因編碼蛋白成為腫瘤免疫治療的靶抗原，以此抗原為主組成的疫苗是目前腫瘤疫苗研究和應用的熱點[2,3]。自1991年van der bruggen 等用基因轉染技術首次在黑色素瘤細胞中分離出mage1基因以來，許多學者對不同mage基因在不同惡性腫

11、瘤組織的表達進行了廣泛研究，但有關mage基因在結直腸癌中表達的報道很少且各家報道的結果不一。scanlan等[6]在關于mage基因的綜述中提出結直腸癌屬于mage基因低表達的腫瘤(以不足30％的基因家族在一種腫瘤中的表達率>20%為標準)。park等[7]研究38例結直腸癌病例的結果顯示，mage1未見一例表達，mage3和mage4陽性表達率分別為5.3%和16.7%，有36.3%的腫瘤標本至少表達一種基因，其表達與患者年齡、性別、腫瘤組織學分型、dukes分期及淋巴結轉移無關(p>0.05)。本實驗僅有mage1表達與年齡有關(p=0.011)，分析原因可能與本組病例老年患者偏

12、少有關。gerhardt等[8]研究26例結直腸癌手術病例的癌組織及癌旁組織、手術切緣和8種細胞株的16種腫瘤抗原基因(主要為mage)的表達情況，認為85%的標本至少表達一種腫瘤抗原，其中mage1表達率為58%，而mage3未見表達。而li等[5]研究121例結直腸癌標本結果顯示mage1、3和4的陽性表達率分別為11.6%、27.3%、22.3%。 本實驗結果顯示mage基因1、3和4的陽性表達率分別為18.5%、33.9%和20%，以mage3表達率較高，53.8%(35/65)的患者至少表達一種抗原基因，而表達與性別、cea值、腫瘤大小、位置、組織分化程度、淋巴結轉移、

13、腫瘤浸潤深度、組織學分級及tnm分期無關，提示這些基因與腫瘤進展情況及惡性程度無關，這與文獻報道的結果相似。相應正常結直腸粘膜組織均未檢測到基因表達，證實了mage在結直腸癌中的特異性表達，并有理由認為mage編碼抗原可能成為結直腸癌特異性免疫治療的攻擊靶點。同時分析結直腸癌組織相同基因研究結果，各家不一，我們認為原因可能有：①標本數不同或標本量太少不能說明整體情況；②pcr引物設計及技術條件的差異；③不同人種表達的hla分子類型不盡相同。 對mage基因表達的分析還發(fā)現，在所檢測的65例標本中呈不均勻分布，表達任意兩種mage基因的標本為27.7%(18/65)，三種同時表達9.2%(

14、6/65)，呈聚集性表達，即表達一種mage家族基因的標本可同時表達其他一種或兩種以上的同一家族基因。mage基因聚集性表達為使用多價疫苗、增強免疫反應提供了可能。本實驗結果顯示mage3在國人結直腸癌中較高表達而正常組織不表達。這種現象就使臨床上有可能將其編碼蛋白作為免疫源用于結直腸癌的腫瘤免疫治療，而mage1和4因其較低的表達率限制了應用價值，與上述研究者的預期結果相吻合。同時我們還注意到在tnm分期ⅰ、ⅱ的早期病例即有較高的表達（mage1、3和4的表達率分別為22.5%、32.5%和25％），說明mage表達有可能是結直腸癌發(fā)生過程中的早期事件，檢測mage基因表達有可能作為結

15、直腸癌免疫學檢測的分子標志物，并且具有作為免疫治療、基因治療特異性靶位的潛在價值。 mage基因在結直腸癌組織的確切表達機制和功能還沒有完全研究清楚。dna甲基化是目前被廣泛接受的關于mage基因表達與沉默的機制，特別是啟動子區(qū)域cpg 島甲基化的狀態(tài)直接影響基因的轉錄失活和表達[9]。dna甲基化異常一般發(fā)生在腫瘤發(fā)生的早期階段，而本實驗結果并未顯示mage基因的表達與腫瘤分期有關。因此，進一步深入研究結直腸癌組織中dna甲基化對其表達調控的影響也是今后我們要研究的課題。 【參考文獻】[1]ries j,schultzemosgau s,neukam f,et al.invest

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