幻燈片1 - 遼寧醫(yī)學院歡迎您

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1、第三章第三章 可移動的遺傳因子（轉座子）可移動的遺傳因子（轉座子） 和染色體外遺傳因子和染色體外遺傳因子 生化教研室生化教研室 肖建英肖建英主要內容主要內容第一節(jié)第一節(jié) 轉轉 座座 子子第二節(jié)第二節(jié) 質質 粒粒第三節(jié)第三節(jié) 遺傳重組遺傳重組第一節(jié)第一節(jié) 轉轉 座座 子子l 轉座子轉座子(transposons) 概念：概念： 在原核生物與真核生物基因組中存在在原核生物與真核生物基因組中存在著可從一個染色體位點轉移到另一位點著可從一個染色體位點轉移到另一位點的一些的一些DNA序列。序列。轉座子是基因組突變的主要因素之一。轉座子是基因組突變的主要因素之一。一、轉座子的分類和結構特征一、轉座子的分類

2、和結構特征（一）原核生物轉座子的類型：（一）原核生物轉座子的類型：1、插入序列、插入序列（insertion sequences，IS） 最簡單的轉座子。最簡單的轉座子。 二個分離的反向末端重復序列二個分離的反向末端重復序列 (inverted terminal repeats, ITR) 一個轉座酶（一個轉座酶（transposase)編碼基因編碼基因 IRTransposase GeneIR2、復合轉座子復合轉座子 類轉座子類轉座子 由由IS類轉座組件構成的復合體。類轉座組件構成的復合體。IRIRTransposase Gene有用基有用基因因組成：組成：兩端為兩端為IS 中間編碼抗生素物

3、質中間編碼抗生素物質3、復雜轉座子、復雜轉座子類轉座子（類轉座子（Tn A家族）家族） 攜帶轉座和耐藥等基因的獨立體家族。攜帶轉座和耐藥等基因的獨立體家族。組成：兩端為組成：兩端為ITR，而不是，而不是IS 中間編碼區(qū)含轉座酶編碼基因，及中間編碼區(qū)含轉座酶編碼基因，及 抗生素抗性和解離酶等編碼基因?？股乜剐院徒怆x酶等編碼基因。4、轉座噬菌體、轉座噬菌體類轉座子類轉座子（二）真核生物轉座子的類型：（二）真核生物轉座子的類型：1、酵母菌中的轉座子、酵母菌中的轉座子Ty因子：因子：2、果蠅中的轉座子、果蠅中的轉座子P因子、因子、FB因子等：因子等：3、玉米中轉座子、玉米中轉座子玉米調控元件玉米調控

4、元件4、逆轉錄轉座子、逆轉錄轉座子逆轉錄病毒、病毒超家族逆轉錄病毒、病毒超家族 及非病毒超家族。及非病毒超家族。l 轉座子的共同特點：轉座子的共同特點： 兩端有反向重復序列兩端有反向重復序列 轉座后靶位點是正向重復轉座后靶位點是正向重復 編碼與轉座有關的蛋白編碼與轉座有關的蛋白轉座酶轉座酶 可以在基因組中移動可以在基因組中移動l 轉座機制：轉座機制：復制型轉座復制型轉座非復制型轉座非復制型轉座保守型轉座保守型轉座二、轉座子機制二、轉座子機制（一）轉座中復制子融合形成共和體（一）轉座中復制子融合形成共和體(cointegrate) 一個含有兩個質粒的細胞，質粒各有一個轉座一個含有兩個質粒的細胞，

5、質粒各有一個轉座子，兩個質粒可以融合在一起形成共和體，這一子，兩個質?？梢匀诤显谝黄鹦纬晒埠腕w，這一過程稱過程稱復制子融合（復制子融合（replicon fusion）。）。AB共和體共和體（二）轉座子的復制過程（二）轉座子的復制過程經(jīng)幾個世代經(jīng)幾個世代（三）轉座作用模型（三）轉座作用模型對稱模型對稱模型 （四）轉座作用模型（四）轉座作用模型非對稱模型非對稱模型 三、轉座效應三、轉座效應1、轉座的遺傳效應：、轉座的遺傳效應：轉座最典型的作用是引起不穩(wěn)定的突變等位基因。轉座最典型的作用是引起不穩(wěn)定的突變等位基因。l 轉座子導致突變，插入致基因失活是轉座最轉座子導致突變，插入致基因失活是轉座最直接

6、的效應。直接的效應。l 轉座也可干擾宿主基因與調控元件之間的關系，轉座也可干擾宿主基因與調控元件之間的關系，或改變或改變DNA結構而影響基因表達。結構而影響基因表達。2、精確轉座的結構效應：、精確轉座的結構效應： 轉座事件可介導兩側的宿主轉座事件可介導兩側的宿主DNA發(fā)生一系列發(fā)生一系列的基因重排。的基因重排。3、異常轉座的效應：、異常轉座的效應： 異常轉座包括：一端轉座；異常轉座包括：一端轉座； 部分轉座部分轉座 隱藏位點轉座隱藏位點轉座 協(xié)同轉座協(xié)同轉座 倒位轉座倒位轉座4、對宿主細胞活力的影響：、對宿主細胞活力的影響： 影響細胞影響細胞DNA代謝，介導基因異常重排。代謝，介導基因異常重排

7、。 三種形式：三種形式： 修復切割所留下的切口修復切割所留下的切口 轉座子內部的重排轉座子內部的重排 轉座子間的重排轉座子間的重排5、轉座子作為研究工具：、轉座子作為研究工具： 主要用于如下研究：主要用于如下研究： 基因傳送載體基因傳送載體 結構重組結構重組 基因表達基因表達 基因突變基因突變 克隆克隆 基因作圖基因作圖四、原核生物和真核生物的轉座子四、原核生物和真核生物的轉座子（一）原核生物的轉座子（一）原核生物的轉座子1、插入序列（、插入序列（IS）與）與類復合轉座子類復合轉座子 二個分離的反向重復序列（二個分離的反向重復序列（ITR） 一個轉座酶（一個轉座酶（transposase)編碼

8、基因編碼基因 l 插入序列是最簡單的轉座子。包括：插入序列是最簡單的轉座子。包括：l 類復合轉座子由耐藥性基因和兩個相同的類復合轉座子由耐藥性基因和兩個相同的IS組成。組成。ISIS抗生素抗性基因抗生素抗性基因IRIRTransposase Gene有用基有用基因因2、轉座子、轉座子A家族（家族（Tn A） 類復雜轉座子類復雜轉座子組成：組成：長約長約5kb，兩端為，兩端為ITR，而不是，而不是IS 中間編碼區(qū)含轉座酶編碼基因，及中間編碼區(qū)含轉座酶編碼基因，及 抗生素抗性和解離酶等編碼基因?？股乜剐院徒怆x酶等編碼基因。u 不是不是IS類轉座組件的復合體，而是攜帶轉座類轉座組件的復合體，而是攜

9、帶轉座和耐藥等基因的獨立體。和耐藥等基因的獨立體。Tn A家族是由許多相關的轉座子組成的。如：家族是由許多相關的轉座子組成的。如： Tn 3、Tn 1、Tn 501等。等。3、轉座噬菌體、轉座噬菌體l 轉座噬菌體是一種溶菌周期和溶源性交替轉座噬菌體是一種溶菌周期和溶源性交替 方式的噬菌體，可誘發(fā)大腸桿菌突變。方式的噬菌體，可誘發(fā)大腸桿菌突變。u Mu噬菌體：噬菌體： 既有溫和噬菌體的特性，又有轉座子的特性。既有溫和噬菌體的特性，又有轉座子的特性。 噬菌體噬菌體DNA的多個拷貝轉座到染色體的多個拷貝轉座到染色體DNA的許的許多位點上，最終由這些染色體上的轉座單位進行多位點上，最終由這些染色體上的

10、轉座單位進行噬菌體包裝。噬菌體包裝。 Mu噬菌體基因組右末端，存在由噬菌體基因組右末端，存在由3kb組成的組成的G片片段，或稱可倒位片段。段，或稱可倒位片段。G片段在不同的片段在不同的Mu噬菌噬菌體體DNA分子中取向不同。分子中取向不同。G片段攜帶兩種不同基因：片段攜帶兩種不同基因：G（）取向時，基因（）取向時，基因 S 和和 U 表達；表達；G（）取向時，基因（）取向時，基因 S和和 U表達。表達。圖圖 G片段片段 p68（二）真核生物的轉座子（二）真核生物的轉座子1、酵母菌中的轉座子、酵母菌中的轉座子Ty因子：因子： Ty因子是一大類轉座子，長因子是一大類轉座子，長6.3kb，兩端各有一段

11、，兩端各有一段長長334bp的順向重復序列，稱為的順向重復序列，稱為成分。成分。 每個酵母細胞基因組大約有每個酵母細胞基因組大約有3035拷貝的拷貝的Ty因子，因子，有約有約100個獨立存在的個獨立存在的成分。成分。2、還原病毒與轉座子：、還原病毒與轉座子： 還原病毒為單鏈還原病毒為單鏈RNA病毒，基因組病毒，基因組RNA長長710kb，有，有gag、pol、env三種基因。三種基因。 還原病毒與轉座子有相似性，可能由祖先轉座子還原病毒與轉座子有相似性，可能由祖先轉座子衍生而來。衍生而來。3、非病毒返座子：、非病毒返座子：u 遺傳信息的移動是從遺傳信息的移動是從DNA到到DNA， 這種轉移過程

12、稱為這種轉移過程稱為轉座（轉座（transposition）；）；被轉移的遺傳信息單元稱為被轉移的遺傳信息單元稱為轉座子（轉座子（ transposon ）u 遺傳信息的移動是從遺傳信息的移動是從DNA到到RNA再到再到DNA， 這種這種RNA介導的轉座作用稱為介導的轉座作用稱為返座作用返座作用；被轉移的遺傳信息單元稱為被轉移的遺傳信息單元稱為返座子返座子。u 真核生物的非病毒返座子都起源于真核生物的非病毒返座子都起源于RNA pol和和的轉錄產(chǎn)物。的轉錄產(chǎn)物。 前者為長散布重復序列，后者為短散布重復序列。前者為長散布重復序列，后者為短散布重復序列。4、玉米調控元件：、玉米調控元件： 是真核生

13、物中首先被發(fā)現(xiàn)的轉座子。是真核生物中首先被發(fā)現(xiàn)的轉座子。玉米調控元件有幾個家族，玉米調控元件有幾個家族，每個家族分為兩大類：每個家族分為兩大類：一類是自發(fā)元件，另一類是非自發(fā)元件。一類是自發(fā)元件，另一類是非自發(fā)元件。五、逆轉錄病毒和逆轉錄轉座子五、逆轉錄病毒和逆轉錄轉座子 以以RNA介導的轉座與逆轉錄病毒有關，被轉移介導的轉座與逆轉錄病毒有關，被轉移的因子稱為的因子稱為逆轉錄轉座子逆轉錄轉座子。 逆轉錄轉座子是真核生物轉座子的重要類型。逆轉錄轉座子是真核生物轉座子的重要類型。n 逆轉錄病毒與逆轉錄轉座子的區(qū)別：逆轉錄病毒與逆轉錄轉座子的區(qū)別： 逆轉錄病毒是具有感染能力的病毒顆粒，可以逆轉錄病毒

14、是具有感染能力的病毒顆粒，可以在細胞之間轉移。在細胞之間轉移。 逆轉錄轉座子是宿主逆轉錄轉座子是宿主DNA基因組的組分，可以基因組的組分，可以在基因組內轉座，但不能在細胞之間轉移。在基因組內轉座，但不能在細胞之間轉移。1、逆轉錄病毒基因組與逆轉錄轉座子結構、逆轉錄病毒基因組與逆轉錄轉座子結構（1）逆轉錄病毒：）逆轉錄病毒： 兩條正鏈兩條正鏈RNA（二倍體）（二倍體） 34個基因，由個基因，由gag、pol、env組成。組成。存在兩種存在兩種mRNA，一種為長的，一種為長的mRNA翻譯翻譯gag和和pol兩種蛋白。兩種蛋白。（2）逆轉錄轉座子：）逆轉錄轉座子： 與逆轉錄病毒結構有許多相似之處，包

15、括：與逆轉錄病毒結構有許多相似之處，包括：同向長末端重復序列、每個重復序列兩側是短同向長末端重復序列、每個重復序列兩側是短反向重復序列、中央?yún)^(qū)域含反向重復序列、中央?yún)^(qū)域含gag和和pol的閱讀框架。的閱讀框架。 但但env基因被破壞或沒有，故逆轉錄轉座子不能基因被破壞或沒有，故逆轉錄轉座子不能形成感染粒子。二者的活性機制是不同的。形成感染粒子。二者的活性機制是不同的。2、逆轉錄病毒與轉座、逆轉錄病毒與轉座u 逆轉錄產(chǎn)生的線形病毒逆轉錄產(chǎn)生的線形病毒DNA，由整合酶催化，由整合酶催化 插入宿主靶位點插入宿主靶位點DNA，這一整合過程與轉座，這一整合過程與轉座 子一樣。子一樣。 病毒病毒DNA的末

16、端相當重要，如發(fā)生突變的末端相當重要，如發(fā)生突變 則抑制整合。則抑制整合。u 逆轉錄病毒感染細胞主要產(chǎn)生兩種結果：逆轉錄病毒感染細胞主要產(chǎn)生兩種結果： 逆轉錄產(chǎn)生原病毒像溶源性噬菌體逆轉錄產(chǎn)生原病毒像溶源性噬菌體DNA一樣，一樣，成為宿主基因組的一部分；成為宿主基因組的一部分； 細胞細胞DNA序列可能與病毒序列重組，并經(jīng)過序列可能與病毒序列重組，并經(jīng)過轉座作用插入新位點，改變細胞的性質。轉座作用插入新位點，改變細胞的性質。3、逆轉錄病毒與轉導、逆轉錄病毒與轉導u 逆轉錄病毒可轉導真核細胞的序列，常被稱逆轉錄病毒可轉導真核細胞的序列，常被稱為為轉導逆轉錄病毒轉導逆轉錄病毒。u 原病毒原病毒DNA

17、整合在整合在C-onc基因附近，二者可基因附近，二者可融合在一起，轉錄后形成一條即含病毒序列又含融合在一起，轉錄后形成一條即含病毒序列又含C-onc的的RNA，后者如含包裝信號可被包裝進，后者如含包裝信號可被包裝進病毒顆粒中，形成含有一條融合病毒顆粒中，形成含有一條融合RNA和一條正和一條正常病毒常病毒RNA的二倍體病毒顆粒。的二倍體病毒顆粒。 二者分子之間發(fā)生重組將會產(chǎn)生二者分子之間發(fā)生重組將會產(chǎn)生轉化逆轉錄轉化逆轉錄病毒基因組。病毒基因組。病毒攜帶病毒攜帶V-onc，即具有轉化能力。，即具有轉化能力。第二節(jié)第二節(jié) 質質 粒粒 質粒（質粒（plasmid）：）： 為多數(shù)細菌和某些真核細胞染色

18、體外的環(huán)狀雙為多數(shù)細菌和某些真核細胞染色體外的環(huán)狀雙鏈鏈DNA分子分子 。特點：特點： 能在宿主細胞內獨立復制，帶有某些遺傳信能在宿主細胞內獨立復制，帶有某些遺傳信息，會賦予宿主細胞一些遺傳性狀。息，會賦予宿主細胞一些遺傳性狀。 但質粒并不是它的宿主細胞所必需的。但質粒并不是它的宿主細胞所必需的。一、質粒的遺傳學類型一、質粒的遺傳學類型1、F 質粒：質粒：為性質粒，是一個小的超螺旋閉環(huán)為性質粒，是一個小的超螺旋閉環(huán)DNA（約（約95kb）。）。 可將宿主染色體基因轉移至另一宿主基因可將宿主染色體基因轉移至另一宿主基因組中，其本身轉移到缺乏組中，其本身轉移到缺乏F 質粒的細胞。質粒的細胞。2、R

19、 質粒：質粒：為耐藥性質粒，由抗性轉移因子為耐藥性質粒，由抗性轉移因子DNA和決定抗性因子和決定抗性因子DNA兩部分組成。兩部分組成。 后者含有對抗生素的抗性基因，使宿主細后者含有對抗生素的抗性基因，使宿主細菌產(chǎn)生對抗生素的抗性。菌產(chǎn)生對抗生素的抗性。3、col 質粒：質粒：含有合成大腸桿菌素基因的質粒，含有合成大腸桿菌素基因的質粒，能殺死不含大腸桿菌素的親緣細菌。能殺死不含大腸桿菌素的親緣細菌。4、質粒噬菌體（噬粒，、質粒噬菌體（噬粒，phagemid）：）： 能把完整的質粒引入某種噬菌體能把完整的質粒引入某種噬菌體DNA成為成為一種嵌合體。一種嵌合體。 嵌合體嵌合體DNA的遺傳學行為取決于

20、某一復制子的遺傳學行為取決于某一復制子的強弱。的強弱。 表現(xiàn)噬菌體行為表現(xiàn)噬菌體行為稱稱質粒噬菌體質粒噬菌體； 表現(xiàn)質粒的行為表現(xiàn)質粒的行為稱稱噬菌體質粒噬菌體質粒。二、質粒二、質粒DNA的特性的特性（一）質粒的復制（一）質粒的復制 依賴細菌染色體的多種酶系統(tǒng)。依賴細菌染色體的多種酶系統(tǒng)。1 1、嚴緊型質粒的復制：、嚴緊型質粒的復制：u 只在細胞周期的一定階段進行復制，與細菌只在細胞周期的一定階段進行復制，與細菌 的繁殖密切相關。的繁殖密切相關。u 需要蛋白質合成和需要蛋白質合成和 DNA DNA polpol 的存在的存在。u 每個細胞只有每個細胞只有 1 15個拷貝。個拷貝。2 2、松弛型

21、質粒的復制：、松弛型質粒的復制：u 在整個細胞周期中隨時都可進行復制。在整個細胞周期中隨時都可進行復制。u 需用需用DNA polDNA pol的存在。的存在。u 在細胞內有在細胞內有1010200200個以個以上上, 甚至多達數(shù)千個。甚至多達數(shù)千個。質粒復制方式：質粒復制方式： 均為半保留復制，并在復制周期內保持環(huán)狀結構。均為半保留復制，并在復制周期內保持環(huán)狀結構。質粒復制形式多樣，包括：質粒復制形式多樣，包括： 單向復制、雙向復制、單向與雙向并存。單向復制、雙向復制、單向與雙向并存。（二）質粒的不相容性（二）質粒的不相容性l 質粒的不相容性是指細菌質粒不能在相同質粒的不相容性是指細菌質粒不

22、能在相同 細胞中同時存在的現(xiàn)象。細胞中同時存在的現(xiàn)象。l 當某種質粒在宿主細胞內存在時，會阻止當某種質粒在宿主細胞內存在時，會阻止 其它質粒進入細胞寄宿，這種質粒稱為其它質粒進入細胞寄宿，這種質粒稱為 不相容質粒。不相容質粒。（三）質粒的轉移性（三）質粒的轉移性l 通過細菌的結合作用，通過細菌的結合作用，F(xiàn) 質粒在不丟失本質粒在不丟失本 身的情況下，可從一個細胞轉移到無身的情況下，可從一個細胞轉移到無F 質質 粒的另一個細胞中。粒的另一個細胞中。圖圖 質粒轉移過程質粒轉移過程 p75（四）質粒中的選擇性標記（四）質粒中的選擇性標記常用的選擇性標記是抗生素抗性基因，包括：常用的選擇性標記是抗生素

23、抗性基因，包括： 1、氨芐青霉素抗性基因、氨芐青霉素抗性基因 2、四環(huán)素抗性基因、四環(huán)素抗性基因 3、氯霉素抗性基因、氯霉素抗性基因cmr 或或 cat常用的質粒載體含有一個或兩個抗生素抗性基因。常用的質粒載體含有一個或兩個抗生素抗性基因。三、特殊細菌質粒三、特殊細菌質粒（一）（一）F 質粒質粒 性質粒性質粒 F 質粒是一種環(huán)狀的質粒是一種環(huán)狀的DNA分子，分子量分子，分子量94.5kb； F 質粒有整合進入細胞染色體而產(chǎn)生質粒有整合進入細胞染色體而產(chǎn)生Hfr細胞細胞 的能力；的能力； 染色體上有染色體上有20多個整合位點，多個整合位點，F(xiàn)質粒對其親和力質粒對其親和力 不同，形成不同，形成Hf

24、r 細胞株的頻率也是不同的；細胞株的頻率也是不同的； F 質粒的整合方向可以是順時針，也可逆時針；質粒的整合方向可以是順時針，也可逆時針； F 質?？蓮囊粋€細胞轉移到另一無質?？蓮囊粋€細胞轉移到另一無F 質粒的細胞。質粒的細胞。（二）（二）R 質粒質粒耐藥性質粒耐藥性質粒 R 質粒由抗性轉移因子（質粒由抗性轉移因子（RTF）和決定抗性）和決定抗性 因子（因子（r-決定子）兩部分決定子）兩部分DNA片段組成。片段組成。 R 質粒含有對抗生素的抗性基因，使宿主細質粒含有對抗生素的抗性基因，使宿主細 菌產(chǎn)生對抗生素的抗性，這種耐藥性是可以菌產(chǎn)生對抗生素的抗性，這種耐藥性是可以 遺傳的。遺傳的。（三）

25、（三）Col 質粒質粒大腸桿菌質粒大腸桿菌質粒 是能產(chǎn)生大腸桿菌素的大腸桿菌質粒，可以是能產(chǎn)生大腸桿菌素的大腸桿菌質粒，可以 抑制或殺死不含抑制或殺死不含Col 質粒的親緣細菌。質粒的親緣細菌。四、真核生物中的質粒四、真核生物中的質粒u 已發(fā)現(xiàn)在單細胞真核生物酵母中有質粒的存在。已發(fā)現(xiàn)在單細胞真核生物酵母中有質粒的存在。l 在高等生物細胞中，即使有質粒的存在，也在高等生物細胞中，即使有質粒的存在，也 遠不如在細菌中那樣普遍。遠不如在細菌中那樣普遍。l 在有性繁殖的高等生物細胞中，質粒在有性繁殖的高等生物細胞中，質粒DNA是是 不能進行轉移的。不能進行轉移的。 殺傷微粒是一個雙鏈殺傷微粒是一個雙

26、鏈RNA分子，這是唯一分子，這是唯一 沒有沒有DNA的質粒。的質粒。 酵母中存在酵母中存在2m質粒，位于細胞核?？截悢?shù)質粒，位于細胞核。拷貝數(shù) 高，每個細胞周期每個高，每個細胞周期每個DNA分子只復制一次。分子只復制一次。常用質粒常用質粒 pBK-CMVpEGSHpSG5pUC18/19pWE15基因工程質粒載體的特點基因工程質粒載體的特點第三節(jié)第三節(jié) 遺傳重組遺傳重組u 遺傳重組的概念：遺傳重組的概念： 在減數(shù)分裂時，通過同源染色體的交換和非在減數(shù)分裂時，通過同源染色體的交換和非同源染色體的獨立分配，使子代細胞的遺傳信同源染色體的獨立分配，使子代細胞的遺傳信息產(chǎn)生了重新組合，這種現(xiàn)象稱為遺傳

27、重組。息產(chǎn)生了重新組合，這種現(xiàn)象稱為遺傳重組。 （genetic recombination） 廣義的遺傳重組：廣義的遺傳重組：指任何產(chǎn)生新的基因組合，指任何產(chǎn)生新的基因組合， 從而造成基因型變化的過程，包括獨立分配從而造成基因型變化的過程，包括獨立分配 或基因交換?；蚧蚪粨Q。 狹義的遺傳重組狹義的遺傳重組：僅涉及：僅涉及DNA分子的斷裂并重分子的斷裂并重新連接而造成基因重新組合的過程，即基因交換。新連接而造成基因重新組合的過程，即基因交換。遺傳重組的類型：遺傳重組的類型：同源重組：同源重組：homologous recombination 位點特異性重組：位點特異性重組：site-spec

28、ific recombination 轉座重組轉座重組: transposition recombination 異常重組異常重組: illegitimate recombination 一、同源重組一、同源重組 （homologous recombination）發(fā)生在發(fā)生在同源序列間同源序列間的重組稱為的重組稱為同源重組，同源重組，又又稱稱基本重組基本重組。是最基本的。是最基本的DNA重組方式。重組方式。通過鏈的斷裂和再連接，在兩個通過鏈的斷裂和再連接，在兩個DNA分子分子大片同源序列間進行單鏈或雙鏈片段的交換。大片同源序列間進行單鏈或雙鏈片段的交換。 1、同源重組的產(chǎn)生：、同源重組的產(chǎn)生

29、：u 產(chǎn)生條件：產(chǎn)生條件：只要兩條只要兩條DNA序列相同或相似，序列相同或相似， 就可以在序列的任何一點發(fā)生同源重組。就可以在序列的任何一點發(fā)生同源重組。普遍公認的是普遍公認的是1964年提出的年提出的Holliday模型，模型，該模型于該模型于1975年得到改進年得到改進：片段重組體和拼接重組體。片段重組體和拼接重組體。2、同源重組的分子機制：、同源重組的分子機制：片段重組體片段重組體基本無重組發(fā)生基本無重組發(fā)生： 切開的鏈與原來斷裂的是同一條鏈，切開的鏈與原來斷裂的是同一條鏈，重組體含有一段異源雙鏈區(qū)，其兩側來自重組體含有一段異源雙鏈區(qū)，其兩側來自同一親本同一親本DNA。拼接重組體拼接重組

30、體交換重組交換重組： 切開的鏈并非原來斷裂的鏈，重組體切開的鏈并非原來斷裂的鏈，重組體異源雙鏈區(qū)的兩側來自不同親本異源雙鏈區(qū)的兩側來自不同親本DNA。 內切酶內切酶 (RecBCD)DNA侵擾侵擾(RecA)分支遷移分支遷移 (RuvAB) 內切酶內切酶(RecBCD) DNA 連接酶連接酶5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 3 3 5 3 5 3 3 5 5 3 5 3 5 3 Holiday中間體中間體5 3 5 3 5 3 5 3 Holiday中間體中間體5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 5 5 3

31、3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 內切酶內切酶(RuvC)內切酶內切酶(RuvC) DNA連接酶連接酶 DNA連接酶連接酶片段重組體片段重組體拼接重組體拼接重組體3、同源重組的酶學、同源重組的酶學對大腸桿菌的研究最為深入，主要蛋白質有：對大腸桿菌的研究最為深入，主要蛋白質有：（1）RecBCD的作用：的作用： RecBCD是一個功能酶，是一個功能酶， 含有三種亞基，具有三種酶活性：含有三種亞基，具有三種酶活性： 核酸酶活性：核酸酶活性：依賴依賴ATP，在，在DNAchi位點右側位點右側 剪切產(chǎn)

32、生剪切產(chǎn)生3游離末端。游離末端。 解旋酶活性：解旋酶活性：需用需用ATP，從，從DNA一端將雙鏈一端將雙鏈 DNA解開。解開。 ATPase活性：活性：水解水解ATP提供能量。提供能量。圖圖 RecBCD 作用機制作用機制 p83（2）Rec A 的作用：的作用：Rec A是重組中最重要的蛋白質，稱是重組中最重要的蛋白質，稱重組蛋白。重組蛋白。l Rec A功能：功能：在在ATP的協(xié)助下，的協(xié)助下， 促進各種促進各種DNA 分子進行同源配對或分子入侵，形成同源配對的分子進行同源配對或分子入侵，形成同源配對的 聯(lián)合分子。聯(lián)合分子。（3）Ruv AB 的作用：的作用：由由A和和B兩種亞基組成，兩種

33、亞基組成， 二者結合在一起才是活性的形式。二者結合在一起才是活性的形式。l RuvAB最主要的功能最主要的功能：憑借其解旋酶活性，：憑借其解旋酶活性， 推動推動Holliday中間體的分支遷移。中間體的分支遷移。（4）Ruv C 的作用：的作用：Ruv C 是一種內切酶，可特異識別是一種內切酶，可特異識別Holliday分支。分支。功能：功能：在重組中誘發(fā)在重組中誘發(fā)Holliday中間體的拆分作用。中間體的拆分作用。l 拆分分三步進行：拆分分三步進行：第一：第一： Ruv C 結合于結合于Holliday中間體；中間體；第二：改變第二：改變DNA構象，需用構象，需用Mg2 或或Ca2 ；第三

34、：切割，需用第三：切割，需用Mg2。4、同源重組的主要途徑、同源重組的主要途徑（1）Rec BCD 途徑：是最重要的一條途徑。途徑：是最重要的一條途徑。（2）Rec F 途徑：在途徑：在Rec BCD 途徑不能運作途徑不能運作 的情況下，大腸桿菌啟動該途徑。的情況下，大腸桿菌啟動該途徑。（3）Rec E 途徑：不用途徑：不用Rec BCD ，也不用，也不用Rec A。 （4）Red 途徑：為重組缺陷途徑，是途徑：為重組缺陷途徑，是噬菌體噬菌體 專用途徑。專用途徑。二、位點特異性重組：二、位點特異性重組： （site-specific recombination ）u 概念：概念：是由整合酶催化

35、，在兩個是由整合酶催化，在兩個DNA序列的序列的 特異位點間發(fā)生的整合。特異位點間發(fā)生的整合。位點特異性重組不依賴于位點特異性重組不依賴于DNA序列的同源性，而序列的同源性，而依賴于能與某些酶結合的特異依賴于能與某些酶結合的特異DNA序列的存在。序列的存在。u 位點特異性重組與同源重組的區(qū)別：位點特異性重組與同源重組的區(qū)別： 同源重組中同源重組中DNA鏈的切斷是完全隨機的；鏈的切斷是完全隨機的； 位點特異性重組位點特異性重組是在某些特異的是在某些特異的DNA 序列處發(fā)生重組。序列處發(fā)生重組。 同源重組后染色體內的同源重組后染色體內的DNA序列一般仍按序列一般仍按 原來的順序排列；原來的順序排列

36、； 位點特異性重組位點特異性重組中中DNA節(jié)段的相對位置節(jié)段的相對位置 發(fā)生了移動，即發(fā)生了移動，即DNA序列發(fā)生重排，從而得序列發(fā)生重排，從而得 到不同的結果。到不同的結果。（一）（一）噬菌體噬菌體DNA對對E.coli 的整合的整合1、噬菌體噬菌體DNA的整合作用：的整合作用：u 噬菌體感染大腸桿菌后，有兩種生活方式：噬菌體感染大腸桿菌后，有兩種生活方式： 裂解生長途徑（溶菌生長）：裂解生長途徑（溶菌生長）：lysis pathway 溶源菌生長途徑：溶源菌生長途徑：lysogenic pathwayl 噬菌體在溶源周期和裂解周期中，其噬菌體在溶源周期和裂解周期中，其DNA 狀態(tài)不同，兩種

37、狀態(tài)的相互轉變（整合與切離）狀態(tài)不同，兩種狀態(tài)的相互轉變（整合與切離） 是通過位點特異性重組實現(xiàn)的。是通過位點特異性重組實現(xiàn)的。 這些特異位點叫附著點（這些特異位點叫附著點（attachment site），）， 簡稱為簡稱為 att。BOB att Batt PPOP IntIHFIntXisIHFBOP POB att Latt R原噬菌體原噬菌體切除切除整合整合細菌細菌DNA噬菌體噬菌體u 噬菌體的整合作用有兩個特點：噬菌體的整合作用有兩個特點： DNA和宿主和宿主DNA的交換是可逆的，的交換是可逆的，原先存在的原先存在的DNA序列全部被保存下來，并序列全部被保存下來，并無丟失。無丟失。

38、 噬菌體和細菌的噬菌體和細菌的DNA之間有一段很短的之間有一段很短的同源序列，重組交換必須通過其中的一個同源序列，重組交換必須通過其中的一個特定的核苷酸。特定的核苷酸。2、噬菌體整合的分子機制：噬菌體整合的分子機制：u 分成三個階段：分成三個階段： 整合酶與整合酶與DNA、宿主、宿主DNA的的 att 位點位點結合形成復合物；結合形成復合物； 鏈交換，兩條鏈形成鏈交換，兩條鏈形成Holliday連接；連接； 拆分拆分Holliday中間體，形成重組分子。中間體，形成重組分子。u 噬菌體整合需要兩種蛋白：噬菌體整合需要兩種蛋白： 整合酶（整合酶（integratase，Int）：）：噬菌體編碼。

39、噬菌體編碼。 有三種功能：有三種功能：噬菌體的插入；原噬菌體的噬菌體的插入；原噬菌體的 切離；拓撲異構酶活性。切離；拓撲異構酶活性。 整合宿主因子（整合宿主因子（integration host factor，IHF） 宿主宿主him A基因編碼，對整合起促進作用?；蚓幋a，對整合起促進作用。u 噬菌體的切除需要三種蛋白：噬菌體的切除需要三種蛋白： 整合酶（整合酶（integratase，Int）：）： 整合宿主因子（整合宿主因子（IHF）：）： 切除酶（切除酶（excisionase，Xis）：）：Xis和和Int結合形結合形成復合物，作用于成復合物，作用于BOP和和POB位點，促進兩者位點

40、，促進兩者之間的相互作用和重組。之間的相互作用和重組。u 整合與切離的反應如下：整合與切離的反應如下：POP(attP) + BOB(attB)Int, IHF, XisInt, IHFBOP(attL) + POB(attR)u 酶蛋白作用的特異性：酶蛋白作用的特異性： Int、IHF只能在只能在attP （POP）上形成整合）上形成整合體，再作用于體，再作用于attB（BOB），繼而切斷、相），繼而切斷、相互交換重組連接?；ソ粨Q重組連接。 Int、IHF不能在不能在attL （BOP）或或attR （POB）上形成整合體，從而決定重）上形成整合體，從而決定重組方向。組方向。 Xis、Int

41、、IHF只能與只能與attL （BOP）或）或attR （POB）上形成另一種整合體，重組結果是上形成另一種整合體，重組結果是 使原噬菌體從宿主基因組上切離下來。使原噬菌體從宿主基因組上切離下來。u 整合需識別整合需識別attP和和attB，切離需識別，切離需識別attL和和attR ，所以，位點特異性重組是通過重組位點，所以，位點特異性重組是通過重組位點的鑒別來控制的。的鑒別來控制的。（二）免疫球蛋白（抗體）（二）免疫球蛋白（抗體）VDJ重排重排1、V（D）J 重排特點：重排特點：u 抗體結構：抗體結構：免疫球蛋白免疫球蛋白(Ig)(Ig)，由兩條輕鏈，由兩條輕鏈(L(L鏈鏈) )和和兩條重

42、鏈兩條重鏈(H(H鏈鏈) )組成。組成。 抗體與外來抗原的結合位置稱可變區(qū)抗體與外來抗原的結合位置稱可變區(qū)（variable regions），又稱），又稱V區(qū)區(qū) ， V區(qū)與抗體區(qū)與抗體 識別有關，決定抗體識別的特異性。識別有關，決定抗體識別的特異性。 抗體分子的其它部位稱為恒定區(qū)（抗體分子的其它部位稱為恒定區(qū)（constant region），又稱），又稱C區(qū)。同一種類抗體，區(qū)。同一種類抗體，C區(qū)不變。區(qū)不變。 免疫球蛋白（免疫球蛋白（Ig）分別由三個獨立的基因家）分別由三個獨立的基因家族編碼，其中兩個編碼輕鏈（族編碼，其中兩個編碼輕鏈（ 和和 ），一個編碼），一個編碼重鏈。重鏈。 因基因家

43、族中有因基因家族中有多種多種V、J、D基因片段基因片段，每條輕鏈只能隨機選擇每條輕鏈只能隨機選擇V、J各一重排，重鏈選各一重排，重鏈選V、D、J 各一重排，才能表達出抗體多肽鏈。各一重排，才能表達出抗體多肽鏈。 這種這種Ig基因重排屬于位點特異性基因重組?；蛑嘏艑儆谖稽c特異性基因重組。重鏈的基因片段：重鏈的基因片段：輕鏈的基因片段：輕鏈的基因片段：L V J C L V D J C u 抗體基因：抗體基因：重鏈重鏈(IgH)(IgH)基因的基因的V-D-JV-D-J重排和輕鏈重排和輕鏈(IgL)(IgL)基基因的因的V-JV-J重排均發(fā)生在特異位點上。在重排均發(fā)生在特異位點上。在V V片段的

44、下片段的下游，游，J J片段的上游以及片段的上游以及D D片段的兩側均存在保守的片段的兩側均存在保守的重組信號序列重組信號序列(recombination signal sequence, (recombination signal sequence, RSS)RSS)。排列規(guī)則總是排列規(guī)則總是12bp12bp序列與序列與23bp23bp序列連接序列連接，這種這種12/2312/23規(guī)則保證輕鏈與重鏈的正確連接。規(guī)則保證輕鏈與重鏈的正確連接。2、重組信號：、重組信號：CACAGTG （12/23） ACAAAAACCGTGTCCAC TGTTTTTGG 重組信號序列重組信號序列 （RSS）53

45、重組酶基因重組酶基因rag (recombination activating gene)共有兩個，分別產(chǎn)生蛋白質共有兩個，分別產(chǎn)生蛋白質RAG1和和RAG2。 u 重組酶的作用：重組酶的作用： 一種酶識別一種酶識別VDJ基因片段兩側的基因片段兩側的RSS序列；序列； 另一種酶切斷七聚體與基因片段，并連接另一種酶切斷七聚體與基因片段，并連接DNA。3、重組酶（、重組酶（recombinase）Ig基因重排通過一組基因重排通過一組VDJ重組酶的作用。重組酶的作用。V片段片段J片段片段RSSRSS間插間插DNAOHOHVJ單鏈切開單鏈切開RAG1RAG2分子內轉酯反應分子內轉酯反應單鏈切開單鏈切開

46、轉移核苷酸轉移核苷酸修復、連接修復、連接免疫球蛋白基因重排過程免疫球蛋白基因重排過程4、V（D）J 重組機制：重組機制：三、遺傳重組在分子生物學中的應用三、遺傳重組在分子生物學中的應用1、轉基因或基因敲除、轉基因或基因敲除2、轉基因技術應用于疾病治療、轉基因技術應用于疾病治療u 轉基因動物的應用：轉基因動物的應用： 建立轉基因動物模型，研究疾病的發(fā)病機制；建立轉基因動物模型，研究疾病的發(fā)病機制； 生產(chǎn)藥用蛋白；生產(chǎn)藥用蛋白； 生產(chǎn)可用于人體器官移植的動物器官；生產(chǎn)可用于人體器官移植的動物器官； 提高家畜的產(chǎn)量；提高家畜的產(chǎn)量； 研究基因的功能及表達調控。研究基因的功能及表達調控。u 轉基因植物

47、轉基因植物提高產(chǎn)量，抗病能力增強等提高產(chǎn)量，抗病能力增強等。3、基因打靶（、基因打靶（gene targeting）復習題復習題1、解釋概念：、解釋概念：轉座子、逆轉錄轉座子、質粒、轉座子、逆轉錄轉座子、質粒、遺傳重組、同源重組、位點特異重組、基因打靶遺傳重組、同源重組、位點特異重組、基因打靶2、簡述原核生物轉座子的類型及組成特點。、簡述原核生物轉座子的類型及組成特點。3、解釋逆轉錄病毒與逆轉錄轉座子的區(qū)別，并、解釋逆轉錄病毒與逆轉錄轉座子的區(qū)別，并 說明逆轉錄病毒是如何轉導真核細胞序列的？說明逆轉錄病毒是如何轉導真核細胞序列的？4、簡述質粒、簡述質粒DNA特性。特性。5、試述大腸桿菌同源重組的、試述大腸桿菌同源重組的RecBCD途徑及參與途徑及參與 的重組酶。的重組酶。6、同源重組與位點特異重組有何不同？、同源重組與位點特異重組有何不同？7、簡述人類抗體多樣性產(chǎn)生的機制。、簡述人類抗體多樣性產(chǎn)生的機制。