牛奶中恩諾沙星和環(huán)丙沙星檢測試紙的研制及性能測定

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1、牛奶中恩諾沙星和環(huán)丙沙星檢測試紙的 研制及性能測定 何丹婷，李艷偉，師偉，趙寧，徐飛 (北京市維德維康生物技術(shù)有限公司,北京100085 ［收稿日期］2011 -05-26［文獻(xiàn)標(biāo)識碼］A ［文章編號］1002- 1280(2011 090036- 04［中圖分類號］S859. 84 ［摘要］應(yīng)用膠體金免疫層析技術(shù)建立了恩諾沙星和環(huán)丙沙星快速檢測試紙 ，并 對試紙條的檢測 限、 特異性和穩(wěn)定性等參數(shù)進(jìn)行了確定。結(jié)果表明，該試紙條對牛奶樣本的檢測 限為50卩g /L能夠特異性地檢測恩諾沙星和環(huán)丙沙星，與液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方 法檢測的陰性樣本符合率為97. 8%。該試紙條在2?

2、8?或室溫可保存12個月， 可應(yīng)用于恩諾沙星在牛奶中的快速篩查現(xiàn)場檢測 。［關(guān)鍵詞］恩諾沙星；膠體金免 疫層析技術(shù)；快速檢測試紙 基金項目：農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項目 (2010GB2A000009 作者簡介：何丹婷(1984年-,碩士，從事動物源性食品安全檢測技術(shù)研究。 E — mail :dantinghe@sina com 通訊作者 ：徐飛。E — mail :aaaxufei@yahoo. com. cn Research and Trait Identification of Colloidal Gold Strip for Rapid Detectio n of En r

3、ofloxac in and Ciprofloxaci n in Milk HE Dan — tin g , LI Yan — wei , SHI Wei , ZHAO Ni ng , XU Fei (Beijing WDWK Biotechnology Co . , Ltd , Beijing 100085, China Abstract :The rapid test strip for detect ion of en rofloxaci n and ciprofloxac in was developed based on colloidal gold immune chrom

4、atographic tech no logy , and its technical parameters , such as sensitivity , specificity and stability were tested respectively The results showed that the LOD of the strip was 50 卩 g /Land was specific for enrofloxacin and ciprofloxacin detection. The coincidenee rate of negative samples was

5、 97. 8%compared with LC — MS /MS . The rapid test strip can be stored at 2? 8?ro room temperature for at least 12m on ths and be applied for rapid en rofloxac in scree ning in milk . Key words :en rofloxaci n ; gold immune chromatographic assay ; rapid test strip恩 諾沙星(Enrofloxacin與環(huán)丙沙星是屬于喹 諾酮類化學(xué)合成

6、的抑菌劑，廣泛應(yīng)用于 畜禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖中支原體和細(xì)菌性疾病預(yù)防與治療，但長期使用會造成組織中藥 物殘留而影響人類健康，因此對恩諾沙星和環(huán)丙沙星的檢測分析具有良好的經(jīng)濟(jì) 效益和重要的社會意義 [1 — 2] 。國內(nèi)外已有微生物 法、色譜法、電化學(xué)法和免疫分析法研究的報道。 本文應(yīng)用制備的恩諾沙星的單克隆抗體 (mAb和膠體金免疫層析技術(shù)(GICA 研制出殘留快速檢測 膠體金試紙，以期為基層大規(guī)模的初篩提供快速、 簡便的檢測方法。1材料與方法1.1材料1.1.1 實驗儀器 Biodot噴膜機(jī),美國Biodot公司 產(chǎn)品；恒溫電磁攪拌器，國華電器；切條機(jī)，上海韓 港電子科技；電熱

7、恒溫培養(yǎng)箱，天津中環(huán)。1. 1. 2 試劑和動物 氯金酸、檸檬酸三鈉等化學(xué)試劑，北京化學(xué)試劑公司；恩諾沙星等各種交叉 反 應(yīng)藥物為常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)品,Dr. Ehrenstofer Gmbh公司 產(chǎn)品；牛血清白蛋白 （BSA、卵清蛋白（OVA , Sigma公司；羊抗鼠IgG ,為美國Jackson Immune Research公司產(chǎn)品；包被原由北京市維德維康生物技術(shù)有限公司制備。 Balb /c小鼠和新西蘭大白兔，國家獸藥安全評價中心實驗動物房提供；人工抗 原CIF - BSA （分子結(jié)合比為11? 1、分泌恩諾沙星特異性抗體細(xì)胞株（編號 ENR5F1、腹水抗體（間接ELISA效價1?

8、2. 56? 105、抗體亞型IgG1,均為北 京市維德維康生物技術(shù)有限公司制備保存。 1. 2 方法［3 — 5］ 1. 2. 1膠體金制備和質(zhì)量鑒定 采用檸檬酸三鈉 還原法制備膠體金，方法參見 文獻(xiàn)［6 — 9］。 1. 2. 2金標(biāo)抗體的制備和純化0. 1mol /L K 2 CO 調(diào)節(jié)膠體金溶液pH值至8. 2,將10mL膠 體金溶液加入50mL燒杯中,電磁攪拌器250 r /min攪拌,逐滴加入1mL 含0. 35mg恩諾沙星抗 體蛋白溶液。逐滴加入3mL 5%BSA ,持續(xù)攪拌10min。 金標(biāo)抗體溶液常溫低速（1500r /min離心20 min ,棄去由凝聚的金顆

9、粒形成的 沉淀。紅色上清 溶液2? 8? , 11000r /min離心40min。溶液 分為三層,透明上 清、管底可流動的暗紅色沉淀及 管底壁上黑色致密的金顆粒層。將可流動的暗 紅色沉淀轉(zhuǎn)移到另外一個離心管中,用含1%BSA的0. 01mol /L磷酸鹽緩沖溶液 （PB混懸至原量。平 衡過夜,同上重復(fù)離心2次。最后用1%BSA的0. 01mol /LPB （含0. 02%疊氮鈉 將沉淀混懸為原 體積的1/40, 2? 8?保存。 1. 2. 3膠體金免疫層析試紙的制備 用玻璃纖維XYZ3050Biodot三維噴點平 臺系統(tǒng)以8卩L /cm將膠體金標(biāo)記的恩諾沙星單克隆抗體點噴在玻璃纖 維上，

10、37?烘 干30min ;用XYZ3050三維噴點平臺 系統(tǒng)以0. 8卩L /cm將抗原（0. 5mg /mL點噴 在硝酸纖維素膜上，即為檢測線；在離檢測線4mm處噴上羊抗鼠IgG （0. 8mg /mL ,即為質(zhì)控線,37?干燥2h o在塑料背板上依次粘貼樣品墊、結(jié)合釋放墊、 硝酸纖維素膜、吸收墊，并在樣品墊外面粘貼保護(hù)膜。 1. 2. 4待檢樣品的處理與結(jié)果判定 取新鮮原奶 樣品600 L加入樣品稀釋液 混勻后,80?水浴2 min后,用滴管取6 8滴滴于樣品孔中,5min后判 定結(jié)果。若 樣品為陰性，加樣后在T區(qū)出現(xiàn)一條紫 紅色條帶；若樣品為陽性，則T區(qū)不會出現(xiàn) 紫紅色條帶。無論樣品

11、中有無恩諾沙星存在，C區(qū)都會出 現(xiàn)一條紫紅色條帶。 1. 2. 5膠體金免疫試紙檢測限的測定 用陰性牛 奶配制恩諾沙星和環(huán)丙沙星 的標(biāo)準(zhǔn)溶液,終濃度分別為10、25、50、75、100卩g /L,按要求對樣品處理后進(jìn) 行檢測，每份樣品重復(fù)5次，5min后目測判斷 結(jié)果。 1. 2. 6膠體金免疫試紙?zhí)禺愋缘臏y定 取恩諾沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙 星、氟甲喹、諾氟沙星、二氟沙星、達(dá)氟沙星、四環(huán)素、鏈霉素、阿維菌 素標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行交叉反應(yīng)率的測定，確定試紙條的特異性。1. 2. 7膠體金免疫試 紙穩(wěn)定性的測定 取三個不 同批次的膠體金試紙，分別置于2? 8?和室溫，于保存的 第0、1、3、6、9、1

12、2個月取出，用陰性牛奶配制恩諾沙星的標(biāo)準(zhǔn)溶液3份,終 濃度為25、50、75ygL,按要求對樣品處理后進(jìn)行檢測,每份樣品重復(fù)5次, 5min后目測判斷結(jié)果。 1. 2. 8假陽性率的測定 取經(jīng)LC — MS /MS確證的陰性牛奶50份,編號為 1# 50#。按要求對樣品 處理后進(jìn)行檢測，每份樣品重復(fù)5次,5min后目測 判斷結(jié) 果。 1. 2. 9假陰性率的測定 取經(jīng)LC — MS /MS確證的陰性牛奶120份,按農(nóng)業(yè) 部第235號公告規(guī)定的 檢測限濃度（100卩g /添加恩諾沙星和環(huán)丙沙星 各60份， 按要求對樣品處理后進(jìn)行檢測，5min后目測判斷結(jié)果。 1. 2. 10儀器比對取5

13、0份空白牛奶樣品，隨機(jī) 添加恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品,制成50 份盲樣。分別采用 膠體金免疫試紙和液相色譜 —串聯(lián)質(zhì)譜（LC — MS / MS兩種 手段進(jìn)行測定，依照下面公式計算陰性樣 本的符合率。儀器方法參照GB /T21312 — 2007《動物源性食品中14種喹諾酮藥物殘留檢測方法 液相色譜—質(zhì)譜 /質(zhì)譜法》所述進(jìn)行操作［10］。陰性樣本 符合率 LC — MS /MS陰性樣本檢出數(shù) ?100%。2 結(jié)果 2. 1膠體金免疫試紙檢測限 從表1的結(jié)果可以看出，恩諾沙星及環(huán)丙沙星添 加濃度為50、75、100卩g /L時檢測結(jié)果全為陽性,添加濃度為25卩g /L時僅有一 份恩諾沙星樣品檢測為

14、陽性，因此本試紙 條在牛奶中恩諾沙星的檢測限為 50卩g /L 0 表1膠體金免疫試紙檢測限的測定 藥物 添加濃度 /（卩 g ^11 1025507510 + ++ 丿^恩^諾沙^星 —++++ — — +++ — — ++ — — +++ — — +++環(huán)丙沙星 ——++ — — +++ +++ 2. 2膠體金免疫試紙?zhí)禺愋?試紙條與喹諾酮類 主要藥物及其他類藥物交叉反 應(yīng)率的結(jié)果如表2所示。測定的結(jié)果表明，膠體金試紙條與喹諾酮類 藥物中除恩 諾沙星和環(huán)丙沙星外的其他喹諾酮類藥物的交叉反應(yīng)率均不到50%,與四環(huán)素、 鏈霉素和阿維菌素不存在交叉反應(yīng)率，因此膠體金免疫試紙能夠特

15、異性地檢測恩 諾沙星和環(huán)丙沙星。 表2試紙條與喹諾酮類主要藥物的交叉反應(yīng)率藥物交叉反應(yīng)率/% 恩諾沙星100. 0 環(huán)丙沙星95. 0 氧氟沙星V 36. 8 氟甲喹V29. 6 諾氟沙星V 15. 6 二氟沙星V 10. 2 達(dá)氟沙星V 9. 8 四環(huán)素V0. 1 鏈霉素＜0. 1 阿維菌素V 0. 1 2. 3膠體金免疫試紙穩(wěn)定性 在空白牛奶樣品 中,按照25、50、75卩g /L三個 濃度進(jìn)行添加，每個濃度添加5份,用試紙條進(jìn)行檢測，試驗結(jié)果如表3所示。結(jié) 果表明，恩諾沙星試紙條在保存于2? 8?或者室溫條件下，可以穩(wěn)定放置12個月而 不影響檢測能力，說明該試紙條

16、的穩(wěn)定性良好，保存期 可以長達(dá)1年。 表3膠體金免疫試紙穩(wěn)定性的測定結(jié)果 添加濃度 2? 8? 25 11 g /L50 卩 g /L75 卩 g /L 室溫（25?2 ? 25 i g /L50 i g /L75 1 g /L 第0個月5份陰性5份陽性5份陽性5份陰性5份陽性5份陽性 第1個月5份 陰性5份陽性5份陽性5份陰性5份陽性5份陽性 第3個月5份陰性5份陽性5份 陽性5份陰性5份陽性5份陽性第6個月5份陰性5份陽性5份陽性5份陰性5份 陽性5份陽性 第9個月5份陰性5份陽性5份陽性5份陰性5份陽性5份陽性 第 12個月5份陰性5份陽性5份陽性5份陰性5份陽性5份陽性

17、 2. 4假陽性率對50份LC - MS /MS確證的陰性 牛奶用膠體金免疫試紙測定 結(jié)果如表4所示。結(jié)果顯示50份陰性牛奶中僅有1份樣本用試紙結(jié)果 檢測為陽 性,通過計算得出,試紙條的假陽性率為98%。 表4陰性牛奶樣品測定結(jié)果 樣品編號結(jié)果 1# 10# 11# 20# + 21# 30# 31# 40# 41# 50# 2. 5假陰性率 按1001 g /L終濃度添加恩諾沙 星至LC — MS /MS確證的60份 陰性牛奶中,編號1 # 60#;按1001 g /L終濃度添加環(huán)丙沙星至 LC — MS /MS確證 的60份陰性牛奶中，編號61# 120#,試紙的檢測結(jié)果如表

18、5所示。結(jié)果表明對120 份添加的牛奶樣本檢測結(jié)果均為陽性，通過計算得出，本試紙條的假陽性率為0, 能夠準(zhǔn)確地檢測出牛 奶樣本中的恩諾沙星與環(huán)丙沙星。 表5陰性牛奶樣品測定結(jié)果 樣品編號結(jié)果 1# 10#++++++++++ 11# 20#++++++++++ 21# 30#++++++++++ 31# 40#++++++++++ 41# 50#++++++++++ 51# 60#++++++++++ 61# 70#++++++++++ 71# 80#++++++++++ 81# 90#++++++++++ 91# 100#++++++++++ 101# 110#++++++++++

19、111# 120#++++++++++ 2. 6儀器比對 分別采用儀器方法［11］和試紙條 方法對50份盲樣進(jìn)行測定，陰 陽性判斷的臨界值 為50卩g /L經(jīng)LC — MS /MS測定，50份樣品中有45份為陰性樣本，5份 陽性（3#、21#、26#、38# 41#。經(jīng)試紙條測定，44份為陰性樣本，6份為陽性 樣本（3#、5#、21#、26#、38#、41#。試驗結(jié)果表 明，本試紙條與LC — MS /MS檢測陰性樣本符合率 為97. 8%。 3討論 恩諾沙星屬于小分子物質(zhì)，采用競爭抑制法對 其進(jìn)行檢測，在建立方法時應(yīng)特 別注意對膠體金顆粒的吸附量和包被抗原量的摸索。恩諾沙星單克隆抗體

20、在進(jìn)行 金標(biāo)時，運用分光光度計測定法和目測法來選擇膠體金與抗體之間的最適比，以減 少目測法時人為因素過多的干涉，使膠體金能與抗體最大限度的結(jié)合。 農(nóng)業(yè)部的235號公告［12］規(guī)定了恩諾沙星在牛 奶中的最高殘留限量為100卩g /L,因此建立方法時必須考慮設(shè)定合適的檢測限?？乖陌涣窟^高，會使試紙條 的靈敏度降低；過低，會使在合格范圍內(nèi)的被檢樣品判為不合格。通?；鶎邮褂? 膠體金試紙作為初篩，篩選為陽性的結(jié)果，再用儀器進(jìn)行 確診。如果靈敏度過高 不僅增加了檢測機(jī)構(gòu)的工作量，同時會造成牛奶生產(chǎn)者的損失。 公告同時也對牛羊的肌肉、脂肪和內(nèi)臟組織中 恩諾沙星的最高殘留限量做出 了規(guī)定，這需要在今

21、 后的工作中摸索動物組織中恩諾沙星的提取方法 ，以使本試紙 條有更廣泛的應(yīng)用。 參考文獻(xiàn)： [1] 姜利英，謝小品，崔光照，等?動物性食品中喹諾酮類藥物殘 留檢測方法的 研究進(jìn)展[J ] ?鄭州輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報,2008, 4 (23 :1-4. [2] 董志遠(yuǎn)，趙曉鳳，宮秀杰，等?牛奶中氟喹諾酮類藥物殘留量 檢測方法的研 究[J ] ?中國獸藥雜志,2008, 42(10 :14- 16. [3]李忠秋,馬紅,郭鎮(zhèn)華,等?免疫 膠體金技術(shù)基本原理及其在 疾病檢測中的應(yīng)用進(jìn)展[J ] ?黑龍江畜牧獸醫(yī)，2006, 9:16- 18. [4]范國英，陳永耀，王順崗，等?鏈霉素快速檢測試紙

22、條的研制 及其性能測定 [J ] ?西北農(nóng)業(yè)學(xué)報，2010, 19(2 :40- 44. [5]劉烜,鄭文杰，賀艷?膠體金免疫層 析法快速檢測組織樣品 中喹諾酮類藥物殘留[J ] ?食品研究與開發(fā)，2009, 5:131134. ⑹李俊鎖，邱月明，王超?獸藥殘留分析[M ] ?上海：上?？茖W(xué) 技術(shù)出版社， 2002. [7] 吳永寧，邵兵,沈建忠?獸藥殘留檢測與監(jiān)控技術(shù)[M ] ?北京:化學(xué)工業(yè)出 版社，2007. [8] Bassab C , Syamal R Manufacturing High Quality Goldsol [J ] . IVD Techn ology , 20

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24、對出現(xiàn)假獸藥較多的經(jīng)營單位依法吊銷經(jīng)營許可 證，加快獸藥GSP的實施，使獸藥經(jīng)營單位樹立產(chǎn) 品質(zhì)量意識。同時，對出現(xiàn)較多假獸藥的企業(yè)進(jìn)行 監(jiān)督檢查和飛行檢查，核查生產(chǎn)企業(yè)的假獸藥確認(rèn) 情況。 表22010年假獸藥匯總表 假獸藥批數(shù)抽檢 批數(shù) 抽樣 批數(shù) 假獸藥占抽樣批數(shù)比例/% 第一季度 3141496181017. 3 第二季度 9373510444721. 1 第三季度 11374267540421. 0 第四季度 7323807453916. 1 合計 3120130801620019 3 4 . 2不合格產(chǎn)品中含量不合格所占比例較大 在2010年度1154批不

25、合格產(chǎn)品 中,含量不合格的產(chǎn) 品共有517批,占不合格產(chǎn)品的比例為44 . 8%。其中個別產(chǎn) 品含量為0、含量無法測定，說明這些企業(yè)未嚴(yán)格按照GMP的要求進(jìn)行規(guī)范生產(chǎn) 建議加大對這類企業(yè)的監(jiān)督檢查，加強(qiáng)日常監(jiān)督檢查及飛行 檢查。 參考文獻(xiàn)： [1] 農(nóng)業(yè)部關(guān)于下達(dá)2010年獸藥監(jiān)督抽檢計劃的通知農(nóng)醫(yī)發(fā) [2010]12號[Z ]. [2] 農(nóng)業(yè)部關(guān)于2010年第二期獸藥抽檢情況的通報農(nóng)醫(yī)發(fā)[2010]23 號[Z ]. [3] 農(nóng)業(yè)部關(guān)于2010年第三期獸藥抽檢情況的通報農(nóng)醫(yī)發(fā)[2010]37 號[Z ]. [4] 農(nóng)業(yè)部關(guān)于2010年第四期獸藥抽檢情況的通報農(nóng)醫(yī)發(fā)[2010]46 號[Z ]. ⑸農(nóng)業(yè)部關(guān)于發(fā)布2011年第一期獸藥抽檢情況的通報農(nóng)醫(yī)發(fā) [2011]7號 [Z ]. [6]吳好庭,歐陽林山.2009年全國獸藥質(zhì)量監(jiān)督抽檢分析[J ].黑龍江畜牧獸 醫(yī)雜志,2011, (4下:34- 35 .