血紅蛋白電泳的意義和判斷高級(jí)版ppt課件

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ADULTANDNEWBORNHemoglobinscreeningwithcapillarys 1 目的 血紅蛋白結(jié)構(gòu)和功能的回顧SebiaCAPILLARYS2 Minicap血紅蛋白檢測(cè)說明血紅蛋白臨床結(jié)果說明 2 血紅蛋白的結(jié)構(gòu) 血紅蛋白分子是由4條多肽鏈 2對(duì) 和4個(gè)可以結(jié)合鐵和氧氣的血紅素 Normalhemoglobins containalpha beta delta andgammaglobinchains 3 三維結(jié)構(gòu) 4亞單位2alpha鏈2alphagenes3 非 alpha鏈 beta delta gamma1bgene 1dgene 2ggenes 4 正常結(jié)果 HbA a2b2 HbF a2g2 HbA2 a2d2 瓊脂糖凝膠Hydrasys Sebia 堿性緩沖液 成人 新生兒 5 血紅蛋白遺傳病類型 HEMOGLOBINOPATHIES 血紅蛋白疾病血紅蛋白性質(zhì)變化 血紅蛋白分子病結(jié)構(gòu)異常 一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸變異或缺失 都將會(huì)導(dǎo)致血紅蛋白分子的電性發(fā)生改變常見血紅蛋白變異體b globin S C DPunjab E 血紅蛋白含量變化 地中海貧血合成或合成調(diào)控異常 bglobin bThalassemiasaglobin aThalassemias合并型 血紅蛋白分子病Hemoglobinopathies 地貧Thalassemias 6 血紅蛋白遺傳病 遺傳性疾病基因?qū)W圖譜 正?；?異常基因 7 異常血紅蛋白類型 目前 已經(jīng)證實(shí)的有超過1000種以上的變異體 a b gandd 大部分變異體出現(xiàn)頻率較低 并且沒有明顯臨床癥狀4種主要變異體 HbS HbC HbEandHbDPunjab 出現(xiàn)頻率較高 特定人群 攜帶者會(huì)出現(xiàn)健康問題兒童可能在出生時(shí)即伴隨有嚴(yán)重癥狀 8 血紅蛋白疾病的區(qū)域分布圖 Thalassemias 9 常見與地中海區(qū)域 意大利 西班牙 希臘 近東地區(qū) 非洲北部 同樣常見于東南亞 泰國 印度 越南 中國 印尼 臨床癥狀 Beta地貧重癥型 嚴(yán)重貧血 需要長(zhǎng)期輸血治療 Beta地貧中間型 Beta地貧輕微型 無臨床癥狀 Beta地中海貧血 常見區(qū)域 bo沒有Beta鏈合成b 合成能力下降 10 Alpha地中海貧血 臨床癥狀 根據(jù)Alpha基因的表達(dá)狀態(tài) 有4個(gè)不同程度的Alpha地貧癥狀 1個(gè)基因表達(dá)沉默 靜止型 非常難檢測(cè)到 在出生會(huì)測(cè)到HbBart s1 2 2個(gè)基因表達(dá)沉默 輕型alpha地貧 在出生會(huì)測(cè)到Bart s2 10 3個(gè)基因表達(dá)沉默 血紅蛋白HbH病 出生時(shí)出現(xiàn)2 30 Bart s 兒童 成人出現(xiàn)10 15 HbH 4個(gè)基因表達(dá)沉默 HbBart s胎兒水腫綜合征 死胎 常見區(qū)域常見與遠(yuǎn)東地區(qū) 非洲和地中海區(qū)國家 11 12 13 鐮刀型紅細(xì)胞血癥 變異體出現(xiàn)在6GAG 谷氨酸 GTG 纈氨酸 14 C型血紅蛋白分子病 變異體位置 AA6 GAG 谷氨酸 AAG Lys H t rozygotecomposite AC SC Chromosomes16 a2 a1 a2 a1 Homozygote Chromosomes11 H t rozygote d b d b A g A g G g G g d b d b A g A g G g G g Chromosomes16 a2 a1 a2 a1 SCheterozygotecompound Chromosomes11 Heterozygote d b d b A g A g G g G g d b d b A g A g G g G g 15 D型血紅蛋白分子病 常見區(qū)域 常見于印度 特點(diǎn) 變異體位置b121Glu 谷氨酸 負(fù)電荷 Gln 谷氨酰胺 不帶電荷 D LosAngeles D Punjab 6differentHbDaccordingtothepositionofthemutation 堿性緩沖液中 電荷下降 M電泳速度變度變慢 靠近HbS 臨床癥狀 基因雜合體 無癥狀 僅在電泳中發(fā)現(xiàn)D區(qū)帶 HbAfraction 65 70 HbDfraction 30 35 基因純合體 輕微貧血HbAfraction absenceHbDfraction 100 16 E型血紅蛋白分子病 常見區(qū)域 常見與東南亞地區(qū) 特點(diǎn) 變異位點(diǎn)b26Glu 谷氨酸 負(fù)電荷 Lys 賴氨酸 正電荷 堿性緩沖液 總體帶電荷下降 凝膠電泳中 出現(xiàn)在HbC附近 臨床癥狀 雜合體 無癥狀HbAfraction 65 70 HbEfraction 30 35 基因純合體 輕微貧血HbAfraction absenceHbEfraction 100 17 下列情況下 需要進(jìn)行血紅蛋白檢測(cè) 臨床和遺傳問題 產(chǎn)前診斷 貧血 小紅細(xì)胞癥新生兒篩查對(duì)來自地貧高發(fā)區(qū)人口 進(jìn)行篩查 對(duì)診斷有幫助的其他信息患者臨床癥狀 年齡 籍貫和其他相關(guān)的背景 輸血記錄 血液全套檢測(cè) 網(wǎng)狀細(xì)胞級(jí)別和進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)鏡檢Hb電泳 EDTA抗凝管 離子平衡和溶血情況 18 血紅蛋白檢測(cè)的幾種方法 目前 血紅蛋白檢測(cè)步驟如下 電泳法對(duì)Hb進(jìn)行檢測(cè)或者使用等電聚焦電泳法 使用HPLC法進(jìn)行確認(rèn) 19 凝膠電泳結(jié)果識(shí)別表 20 等電聚焦電泳法 在pH梯度的凝膠片上 根據(jù)蛋白不同的等電點(diǎn) 對(duì)蛋白進(jìn)行分離Hb電泳位置取決于緩沖液PH值蛋白電泳至其等電點(diǎn)位置后 停止泳動(dòng)AtpI pH Hbdoesnothaveanetchargeandstopsmigrating電泳分離效果好 但時(shí)間長(zhǎng) 需要經(jīng)驗(yàn)豐富才能獲得良好結(jié)果及進(jìn)行結(jié)果判斷 21 介于普通電泳和等電聚焦電泳之間的新方法 通過毛細(xì)管電泳法 即可以獲得與IEF方法一樣的分辨率 同時(shí)檢測(cè)結(jié)果量值HbA2 HbF同樣精確 出現(xiàn)異常變異體后 使用下列方法確認(rèn) ITANOtest solubilitytest HPLC液相色譜 Genotyping基因篩查 22 Capillarys2 Minicap 全自動(dòng)毛細(xì)管電泳法進(jìn)行血紅蛋白檢測(cè)Capillarys2 Minicap 23 毛細(xì)管電泳法原理 24 此時(shí) 電滲力 EOF 遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于電場(chǎng)力 因此 蛋白被動(dòng)從正極向負(fù)極端移動(dòng) 正電極 EOF 負(fù)電極 Electromigration 蛋白電泳 DETECTION INJECTION 25 Capillarys Minicap血紅蛋白電泳 血紅蛋白條帶 在電滲力的作用下 8分鐘即完成電泳過程 然后 在415nm紫外光下被檢測(cè)并顯示出來 正常質(zhì)控品必須在每天檢測(cè)前使用Capillarys 檢測(cè)速度 40樣品 小時(shí)試管架1至7號(hào)位放置樣品 8號(hào)位放4ml溶血素Minicap 檢測(cè)速度 10樣品 小時(shí)試管架1至26號(hào)位放置樣品 27號(hào)位放溶血素 8個(gè)樣品消耗5ml溶血素 26 Capillarys Minicap血紅蛋白檢測(cè)標(biāo)本要求 抗凝管采血 EDTA heparin citrate 如果需要對(duì)輸血患者采血 需要在輸血前采集血液 使用去除血漿后的紅細(xì)胞 隔夜或5000rpm 5分鐘離心后樣品 4 C以上 標(biāo)本最多存放7天 需要長(zhǎng)期存放 可以洗滌紅細(xì)胞后 放置于 80 C 可存放至少3個(gè)月 27 CapillarysMinicap血紅蛋白條帶識(shí)別表 Capillarys Minicap區(qū)帶識(shí)別表 Z15 HbHZ14 Z13 Hb JRovigo HbN Baltimore J KaoshiungZ12 HbBart s HbProvidence HbJ Mexico HbJ Baltimore Z11 HbKaoshiung NewYork denaturatedHbAZ10 HbHope HbM IwateZ9 HbA HbCamperdown HbPhnomPenh Z8 AcetylatedHbF HbAltanta HbAthens GAZ7 HbF denaturatedHbS HbPorto Allegre Z6 HbD Punjab HbPhiladelphia HbKorle Bu HbLepore HbK ln denaturatedHbE Z5 HbS HbHasharon HbHandsworth denaturatedHbO Arab Z4 HbE denaturatedHbC HbK ln HbA2variants M IwateHbA2variantsZ3 HbA2 HbO ArabZ2 HbC HbConstantSpring SetifHbA2variantZ1 HbdA2HbaA2 HasharonHbA2variant WinnipegHbA2variant 29 正常HbA2質(zhì)控品 條帶結(jié)果可錄為QC 30 HbAFSC質(zhì)控品 可用來作為參照曲線 便于異常結(jié)果的判斷 31 HbsA F A2檢測(cè)結(jié)果可通過顏色進(jìn)行區(qū)分 異常區(qū)帶顯示為灰色 32 主要異常血紅蛋白變異體 Z15 HbHZ12 HbBartZ10 HbHopeZ9 HbAZ7 HbFZ6 HbDPunjabZ5 HbSZ4 HbEZ3 HbA2Z2 HbC HbE HbS HbH 33 HbS變異體 HbA2正常值 6Glu Val HbA 2 2 HbS 2 S2 HbA2 2 2 34 Capillarys Minicap血紅蛋白試劑優(yōu)勢(shì) 無需前處理 不需要洗血和溶血 直接檢測(cè)血紅蛋白C和E能從A2分離開根據(jù)S型和D型的細(xì)微電荷區(qū)別 進(jìn)行區(qū)分 對(duì)于處于A和S之間的F給予個(gè)性化和聚焦的精確量化 對(duì)A2型血紅蛋白有很好的分辨率和分離效果HbBarts和HbH可以很好的檢測(cè)和量化糖化型血紅蛋白電泳出現(xiàn)在主體峰內(nèi) 不影響檢測(cè)結(jié)果 35 異常結(jié)果分析 36 Case2 31YFemale 血紅蛋白12 8 紅細(xì)胞壓積37 4 I A 84 1 F 1 5 A2 5 5 37 31YFemale Hgb12 8 Hematocrit37 4 II Alk Acid F S C A2 C S F thalassemia 輕型 A2 A A A A C P C P A 93 4 F 1 1 A2 5 5 38 HbA92 5 HbF2 6HbA24 9 HbF HbA HbA2 67YfemalefromTunisia Hgb9 1 hematocrit28 MCV62 小紅細(xì)胞癥 betathalassemia輕型 39 HbH4 HbA94 7 HbA21 3 HbA HbA2 HbH Child9Y fromLaos Hgb8 hematocrit27 9 MCV54 1 嚴(yán)重小紅細(xì)胞癥 血紅蛋白H病 需要基因篩查 40 HbHandBart s Alpha thalassemia HBarts 41 Case1 13YMale Hgb8 1 Hct24 0 I A2 6 1 S 82 8 42 Case1 13YMale Hgb8 1 Hematocrit24 0 II Alk Acid F S C S A2 F C S F S HgbF S A2 4 6 betathalassemiaminor A2 A F A C P C P 43 Case2 65YMale Hgb9 4 Hematocrit27 3 I Co migrationwithA2 A 62 1 A2 31 7 44 Case2 HbEMigratesSeparatelyFromHbA2 26Glu Lys 45 21Y pregnantwoman Hgb13 1 hematocrit38 6 HbA95 HbF2 1 HbA22 9 Normalpattern HbFslightlyincreased pregnancy 46 Baby2monthsold fatherfromMartinique motherfromCentralAfrica Hgb11 hematocrit29 8 HbF49 5 HbS25 9 HbA21 8 HbC22 8 HbF HbS HbA2 HbC SCcompoundheterozygoty 47 Diabeticpatient 54Y Hgb14 5 hematocrit43 5 MCV88 HbA1cmeasurement HPLCTosoh HbA54 7 HbX41 7 HbA23 6 HbA HbA2 HbX Normalhemogram compatiblewithheterozygoteA D Tobeidentifiedbygenotyping 48 HbA51 8 HbA22 9 HbC35 9 HbA HbA2 HbC Diabeticpatient 61Y Hgb11 6 hematocrit34 8 MCV85 Slightanemia compatiblewithheterozygoteA CTobeidentifiedbygenotyping 49 Adoptedchild 4Y originatedfromHaiti Hgb10 9 Hematocrit31 3 MCV76 9 HbA97 5 HbA21 4 HbX1 1 HbA HbA2 HbX Slightanemia heterozygousDeltamutation asymptomatic 50 Diabeticpatient 73Y Hgb10 2 hematocrit30 8 MCV87 3 Alphachainmutation genotypingconfirmation HbWinnipega75AspTyr HbA Wi HbA2 Wi HbA HbA2 51 HbA90 3 HbF3 8 HbA25 9 HbA HbF HbA2 HbA64 HbS33 1 HbA22 9 HbA HbS HbA2 HbA2 2 HbF67 3 HbS29 1 HbA21 4 HbA HbF HbS HbA2 Father BetathalassemiaminorMother HeterozygoteAS Baby2monthsold AssociationS betathalassemia 52 HbLeporeonMinicap Capillarys N Ac A0 Lepore A1 HbA2 HbA HbF HbLepore AFSCcontroloverlaying 53 HbLepore b和d鏈重新組合形成 在堿性緩沖液下電泳 總體帶電荷下降 電泳位置出現(xiàn)在S型血紅蛋白附近 基因雜合體 HbLeporefraction 5 15 Clinicalsignsofminorbthalassemia 基因純合體 HbLeporefraction about30 Clinicalsignsofhomozygousbthalassemia 常見區(qū)域 Lepore Boston Washington 常見于意大利人群 同樣常見于在羅馬尼亞 澳大利亞和墨西哥人群 特點(diǎn) 54 a47Asp His HbHasharon HbA HbA2 HbF HbHasharon HbHa A2 HbO Arab b121Glu Lys HbA2 O Arab HbF HbA 56 DIAGNOSTICFLOW CHART 57 ANEWFASTHEMOGLOBINELECTROPHORESISMETHODFORDRIEDBLOODSPOTSONSEBIACAPILLARYS AUTOMATEDSYSTEM 58 現(xiàn)有的新生兒血紅蛋白篩查方法 SCD 新生兒血紅蛋白檢測(cè) 等電聚焦 IEF 高效離子交換液相色譜法 CE HPLC 毛細(xì)管電泳方法可取代常規(guī) 操作復(fù)雜的等電聚焦方法 59 新生兒血紅蛋白快速檢測(cè)法 取血板 BSD600全自動(dòng)打孔器 全自動(dòng)溶血 樣品稀釋和檢測(cè) 條碼識(shí)別 取血板條碼 樣品稀釋杯條碼 使用純凈水洗脫樣品 60 與IEF方法比較 毛細(xì)管方法優(yōu)勢(shì) 對(duì)于常見異常血紅蛋白變異體有100 區(qū)分能力 HbS C D E 對(duì)其他非常見變異體有良好檢測(cè)能力對(duì)不同類型樣品擁有相同檢測(cè)能力 新生兒 早產(chǎn)兒或者進(jìn)行過輸血患兒樣品全程檢測(cè)溯源性 取血板和樣品稀釋杯使用條碼高效性 48個(gè)樣品 小時(shí) 576樣品 天4小時(shí)人機(jī)分離操作 最多可進(jìn)行3X192個(gè)樣品檢測(cè)可選擇使用與毛細(xì)管匹配的全自動(dòng)打孔機(jī) 完全自動(dòng)化處理樣品無需人工進(jìn)行樣品轉(zhuǎn)移 避免交叉污染該項(xiàng)目檢測(cè)完全自動(dòng)化 從前處理到檢測(cè) 直到結(jié)果分析 全程無需人工干預(yù) 61 使用標(biāo)準(zhǔn)取血板 在室溫下進(jìn)行干燥 干燥的取血板可在2 8 C下 保存1個(gè)月 新生兒血紅蛋白檢測(cè)的樣品要求 通過顏色區(qū)分正常及異常樣品 正常血樣 withHbFandHbA acetylatedHbF 異常血樣 63 提供樣品檢測(cè)完整溯源性 通過樣品ID 試劑杯和全自動(dòng)打孔器的數(shù)據(jù)記錄完成數(shù)據(jù)交換 異常樣品自動(dòng)顯示 64 電泳圖譜說明 檢測(cè)到條帶的位置 圖譜會(huì)自動(dòng)定位 鼠標(biāo)經(jīng)過的區(qū)帶位置 會(huì)顯示出該區(qū)帶的所有可能出現(xiàn)的異常血紅蛋白名稱 N1toN13 新生兒血紅蛋白檢測(cè)條帶名稱識(shí)別表 N13 HbBart sN12 N11 HbHope Gammachainvariants denaturedHbAN10 HbAN9 DenaturedHbFN8 N7 HbFN6 N5 HbD Punjab HbG Philadelphia HbKorle BuN4 HbS acetylatedgammachainvariantsN3 HbE HbF OuledRabah gammachainvariants MethemoglobinN2 HbA2 HbO Arab HbF OuledRabah gammachainvariantsN1 HbC 66 正常血樣 Birth 19 01 06Samplecollection 24 01 06Term 39w Weight 3445g 67 輸血后檢測(cè)結(jié)果 Birth 29 01 06Samplecollection 01 02 06Term 38w Weight 3100g 68 F Shomozygote Birth 05 01 06Samplecollection 08 01 06Term 37w Weight 3490g HbS HbF DenaturedHbF 69 早產(chǎn)兒體內(nèi)的F S DenaturedHbF HbF HbS Birth 20 02 06Samplecollection 23 02 06Term 34w Weight 1300g 70 F SCcompoundheterozygote DenaturedHbF HbF HbS HbC Birth 30 01 06Samplecollection 02 02 06Term 40w Weight 3900g 71 F ASheterozygote HbA HbF HbS Birth 16 12 06Samplecollection 19 12 06Term 36w Weight 2780g 72 F Chomozygote HbF HbC DenaturedHbF Birth 20 12 05Samplecollection 24 12 05Term 39w Weight 3160g 73 F ACheterozygote Birth 18 12 06Samplecollection 21 12 06Term 40w Weight 3035g 74 F ACinaprematurenewborn Birth 17 10 05Samplecollection 20 10 05Term 30w Weight 2330g 75 F ADheterozygote Birth 29 01 06Samplecollection 31 01 06Term 37w Weight 3280g 76 F Ehomozygote HbE HbF DenaturedHbF Birth 10 11 06Samplecollection 13 11 06Term 40w Weight 77 F AEheterozygote Birth 10 03 06Samplecollection 13 03 06Term 39w Weight 3420g 78 F AEinaprematurenewborn Birth 21 07 05Samplecollection 24 07 05Term 35w Weight 1840g 79 F A0 Arabheterozygote Birth 14 02 06Samplecollection 17 02 06Term 40w Weight 3120g 80 F AKorle Buheterozygote Birth 31 10 06Samplecollection 03 11 06Term 40w Weight 3790g 81 Bart sinatermnewborn Birth 05 04 06Samplecollection 08 04 06Term 38w Weight 2790g 82 對(duì)新生兒血紅蛋白的定量檢測(cè) 83 AFcontrol HbA HbF HbA2 Hbquantification 84 Normalblood HbA HbF Hbquantification RatioA F 85 F ASheterozygote HbA HbF Hbquantification HbS RatioA S 86 F ACheterozygote HbA HbF RatioA C HbC Hbquantification 87 HbBart sinanewborn HbA HbF Hbquantification HbBart s 88 Cordbloodanalysis 特定程序下使用普通血紅蛋白試劑盒 89 CORDBLOOD normalsample 90 CORDBLOOD a Thalassemia 91 CORDBLOOD HeterozygoteA D Punjab 92 CORDBLOOD HeterozygoteA S 93 總結(jié) 血紅蛋白疾病 CAPILLARYS新生兒和臍帶血血紅蛋白檢測(cè)可作為等電聚焦方法和液相色譜法的替代技術(shù)如需對(duì)特殊檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行確認(rèn) 可選擇其他方法 液相色譜 基因篩查 94 Thankyouforyourattention 95