高中生物《細胞凋亡》課件3（111張PPT）（中圖版必修1）

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歡迎進入生物課堂 細胞凋亡 細胞凋亡CellularApoptosis一 概論 隨著生物學研究的深入 生物學家越來越意識到細胞死亡 特別是細胞凋亡具有特殊的生物學意義 對于一個多細胞生物來說 要維持完整性和保持平衡性 凋亡是一個非常重要的生物學過程 多細胞生物的誕生 生長 發(fā)育 存活以及死亡 無一不伴隨著細胞凋亡過程 細胞死亡是組織病理學的中心議題 細胞死亡現(xiàn)象也是生命新陳代謝的固有本質(zhì) 例如胚胎發(fā)育 embryonicdevelopment 正常組織更新 Normaltissueturnover 以及在增殖淋巴細胞群體中選擇適當?shù)目寺?selectionofappropriateclones 這種細胞生理性死亡是種系發(fā)育史中早就存在的 有利于動物發(fā)育中的許多生命功能 1972年Keer根據(jù)細胞發(fā)生了與壞死完全不一樣的死亡過程而提出了細胞凋亡 Apoptosis 的概念 80年代末 細胞凋亡成為新的醫(yī)學研究熱點 正是由于發(fā)現(xiàn)了細胞凋亡的規(guī)律 三位科學家獲得了2002年的諾貝爾醫(yī)學或生理學獎 他們是英國的西德尼 布倫納 美國的H 羅伯特 霍維茨和英國的約翰 E 蘇爾斯頓 二 凋亡概念 細胞凋亡是細胞循自身程序結(jié)束其生命的主動死亡的過程 具有特征的形態(tài)和生化改變 是由基因控制的個別細胞發(fā)生的自主有序的死亡 即是由基因控制細胞有目的 有選擇性的自我消亡過程 這種淘汰機制是保證生命進化的基礎 三 凋亡的形態(tài)特征凋亡發(fā)生的過程表現(xiàn)為細胞死亡 dyingprocess 和被清除 eliminationprocess 細胞縮小 致密染色質(zhì)邊集 核碎片 凋亡小體 1 喪失了特殊的表面結(jié)構 微絨毛等 和接觸區(qū) 形成光滑的輪廓 從周圍活細胞中分離出來 2 細胞縮小 胞漿細胞器集中 squeeze 胞膜出芽或起泡 bleb 細胞皺縮 shrinkage 3 保持胞漿細胞器完整性掃描電鏡下 細胞表面呈奇特火山口樣外觀 線粒體不腫脹 內(nèi)膜不破裂 短暫滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng) SEN 擴張 擴張間隙與細胞表面融合 有時有聚積排例的半結(jié)晶狀核糖體 可有與細胞表面平行的微絲束 4 形成調(diào)亡小體 Apoptoticbodies 由凋亡細胞裂解為若干個由質(zhì)膜包繞的小體 每個凋亡小體有自己的一簇細胞器 周圍不引起炎癥反應 5 核內(nèi)染色質(zhì)結(jié)構改變 這是最引人注意的改變 染色質(zhì) chromatin 凝集于核膜下表現(xiàn)為 核質(zhì)固縮 condenation 邊集 margination 核漿緊實 compaction 核膜皺折 fold HE 1000 小鼠凋亡肝細胞 HE 1000 小鼠凋亡肝細胞 在透射電鏡下 染色質(zhì)濃縮在一起呈顆粒狀 半月形磨茹 或完整的捻珠形 核孔集中于少數(shù)區(qū)域 濃縮的染色質(zhì)并不貼附在核膜上 轉(zhuǎn)錄復合物從核仁中脫落到核漿中呈一簇嗜鋨酸小體 殘留的核仁蛋白核心移到周圍染色質(zhì)特征性部位 核扭曲 斷裂呈若干片斷 所有片斷開始時均有質(zhì)膜包繞 6 凋亡細胞 凋亡小體被識別與吞噬 凋亡細胞或凋亡小體迅速被吞噬同質(zhì)或異質(zhì)細胞吞噬體 phagosome 進一步變性溶酶體殘留小體 lysosomalresidualbodies 偶爾凋亡小體逃避被吞噬 如凋亡的導管上皮掉入管腔 幾點說明 1 形態(tài)學改變告訴我們凋亡細胞發(fā)生早期細胞體積縮小 50 密度增加 胞漿細胞器保留完整 說明細胞是有選擇性的喪失了水和電解質(zhì) 而較致密的結(jié)構成分得以保留下來 這種水分的迅速輸出可能在內(nèi)質(zhì)網(wǎng) 使之在與細胞表面融合前呈短暫性擴張 2 胞漿胞核冒泡的機制還不十分清楚 Fesus發(fā)現(xiàn)在這個時相中 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶 trangluamirase 活性可在受損細胞中檢測到 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶是交聯(lián)蛋白酶 能使蛋白質(zhì)成為不溶解的 具有高度化學上變質(zhì)的一種化學劑 在凋亡細胞膜下構成一層由轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶化的蛋白質(zhì)僵硬殼 這就很容易引起某些細胞的形態(tài)改變 并與凋亡細胞體積縮小和不溶解性有關 3 凋亡細胞 凋亡小體被鄰近特殊吞噬細胞或其它細胞識別與吞噬 需要一種特殊的非免疫性識別機制 最近發(fā)現(xiàn)吞噬細胞上至少有三類受體 凋亡細胞上出現(xiàn)有相應的凋亡標記 介導兩者相互應答反應 凋亡細胞表面膜結(jié)構改變 表面糖蛋白失去唾液酸側(cè)鍵 使原來處于隱蔽狀態(tài)的單糖暴露出來 與吞噬細胞表面的植物凝集素結(jié)合被吞噬 細胞膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸翻露到細胞外 被吞噬細胞表面相應的受體識別 吞噬 吞噬細胞可以分泌一種物質(zhì)即血栓連接素 thrombospoudin 在血小板 巨噬細胞 內(nèi)皮細胞 纖維母細胞中可粘附FN 纖維蛋白原和糖蛋白 介導多種細胞表面的蛋白多糖 硫酸脂等受體與凋亡小體表面的相應成分結(jié)合而將之吞噬 4 定時電動攝像研究發(fā)現(xiàn) 凋亡發(fā)生開始得很突然 受致死刺激后不久 被攻擊的細胞突然皺縮 冒泡并凋亡 這時期僅僅持續(xù)數(shù)分鐘 然后產(chǎn)生皺縮的凋亡小體 凋亡小體一旦形成 停留在組織中被辯認出來的時間約4 9小時 這段時間與巨噬細胞在體內(nèi)吞噬大生物結(jié)構完全被降解的時間相符 由于這一過程很短 因此在組織切片中 所見到的凋亡小體即便是少量的增加 也可能隱藏著較大的細胞喪失率 例如在歷經(jīng)3天細胞數(shù)目已喪失一半的萎縮組織中 這時在光鏡下見到的凋亡小體數(shù)還不到細胞總數(shù)的5 凋亡發(fā)生迅速 在幾小時內(nèi)即完成主要的二個階段 細胞死亡階段 thedyingprocess 和細胞被清除過程 theeliminationprocess 凋亡細胞迅速被吞噬 其空隙由周圍細胞來填充 因此不留痕跡 凋亡小體的完整膜 使之缺乏炎癥反應 5 盡管凋亡對細胞死亡來說是非常有意義的生物行為 但仍含糊不清的概念 其后果是凋亡表現(xiàn)在不同組織中 有不同的名稱 如 著色體的巨噬細胞 tingiblebodymacrophages 在淋巴濾泡生發(fā)中心中存在的含有凋亡淋巴細胞的巨噬細胞 civattebodies在牛皮癬時所見到的凋亡性角化細胞 councilmanbodies凋亡的肝細胞等 civattebodies在牛皮癬時所見到的凋亡性角化細胞 H E10 50 鏡下肝細胞嗜酸性小體 H E10 40 鏡下凋亡小體apoptoticbody 四 凋亡發(fā)生的機制主要通過受體介導的信號途徑 receptor mediatedcellularsignallingpathways 誘導細胞凋亡因子或刺激因素通過第二信使系統(tǒng)傳遞信號 信號傳遞途徑?jīng)Q定了細胞的命運 核酸內(nèi)切酶180 200bpDNA片段各種內(nèi)源性細胞內(nèi)鈣離子濃度增加蛋白酶細胞骨架崩解細胞皺縮和外源性刺激 細胞內(nèi)降解級聯(lián) 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶胞漿蛋白交聯(lián)細胞固縮 1 核酸內(nèi)切酶 endonuclease 的活化將DNA在核小體間連接區(qū) internucleosomallinkageregion 切成缺口 Nick 使核內(nèi)DNA斷成片斷 而胞漿DNA保留完好 DNA斷點都是規(guī)律性的發(fā)生于核小體之間 因此出現(xiàn)180 200bp及其倍數(shù)的DNA片段 2 組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶 tissuetranglutaninaseTTG 活化催化 lr 谷氨酰賴氨酸交聯(lián)形成僵硬而不溶性蛋白 在老化與終末分化的角化上皮中TTG活化形成包鞘蛋白 involucrin 這些蛋白可以網(wǎng)絡住細胞內(nèi)細胞器等容物 不易溢出 3 鈣依賴蛋白酶 calcium dependentproteinase 活化破壞細胞骨架結(jié)構 形成細胞表面泡狀起 如果阻斷胞漿鈣濃度可以抑制凋亡發(fā)生 增加胞漿鈣濃度可以促進凋亡 所謂自發(fā)性 spontaneous 凋亡的發(fā)生 是組織內(nèi)區(qū)域?qū)Ω鞣N致畸物 teratogen 異體生物素 Xenobiotics 十分敏感 這也是細胞衰老的特征 是對許多損傷性刺激的極度脆性 所以在生化水平上凋亡細胞可以發(fā)生一系列基因表達和蛋白合成 細胞凋亡的途徑來自細胞內(nèi)外的各種信號可誘導不同的細胞發(fā)生凋亡 但凋亡的不同類型細胞卻呈現(xiàn)一致的特征性形態(tài)和生化改變 這些改變由半胱氨酸蛋白酶家族 caspases 蛋白降解所造成 按啟動caspase酶和信號轉(zhuǎn)導機制的不同 將凋亡的發(fā)生分為兩條途徑 外源性 即死亡受體 deathreceptor DR 介導途徑 內(nèi)源性 也稱為線粒體介導途徑 它們通過一系列分子和生物化學途徑導致兩個途徑共同的 中央處理器 分子即caspase的活化 并誘導許多細胞核和細胞漿內(nèi)相關底物的降解 1 外源性途徑及其主要成分的結(jié)構 功能與激活 死亡配體 deathligands 結(jié)合DR而促發(fā)的凋亡 這些配體包括TNF FasL TRAIL Apo3L 也稱為死亡因子 相應的死亡受體包括TNF R Fas CD40 OX40 4 1BB 它們胞內(nèi)區(qū)都具有一約80個氨基酸殘基組成的保守的蛋白結(jié)合域 是傳導細胞死亡信號所必須的 稱之為死亡功能域 deathdomain DD Fas FasL系統(tǒng)FasL與Fas結(jié)合可以導致Fas胞內(nèi)的死亡域形成三聚體而活化 并引起與之結(jié)合的FADD構象改變 使caspase 8前體激活 從而激發(fā)一系列下游的caspase級聯(lián)反應 誘發(fā)細胞凋亡 這是一條基本的通過DD和FADD的細胞凋亡調(diào)控途徑 FasL和Fas系統(tǒng)除了大家已熟知的誘導死亡的功能外 還有導致細胞活化和增生的功能 腫瘤壞死因子 TNF 系統(tǒng)TNF是由157個氨基酸亞單位組成的同源三聚體 主要是由因為感染而活化的巨噬細胞和T細胞產(chǎn)生 通過TNF R1 TNF可以誘導細胞凋亡 TNF三聚體與TNF R1的胞外功能域結(jié)合 啟動信號轉(zhuǎn)導 募集TNF R1啟動的信號轉(zhuǎn)導中的關鍵酶與蛋白結(jié)構域的活化 2 線粒體途徑及其主要成分的結(jié)構 功能與激活 線粒體結(jié)構及基本激活途徑啟動凋亡的關鍵因素是線粒體功能紊亂 線粒體是雙層膜包裹的囊狀結(jié)構其上含有豐富的腺苷酸載體 adeninenucleotidetransporter ANT 電壓依賴性離子通道 voltage dependentanionchannel VDAC bcl 2分子等 外膜通透性較大 容許分子量在15KD以下的物質(zhì)自由通過 內(nèi)膜通透性小 大于1 5KD物質(zhì)不易通過 該雙層膜通透性的改變在細胞凋亡中起重要作用 而外膜通透性改變與內(nèi)膜相比更具有凋亡特征 線粒體調(diào)節(jié)細胞凋亡有3種機制 線粒體電子傳遞與能量代謝的破壞 細胞氧化狀態(tài)的改變 線粒體膜通透性改變導致介導細胞凋亡的分子的釋放 線粒體膜通透性的改變可釋放多種分子啟動凋亡caspase前體細胞色素c Cyt c caspase的激活劑 第二個線粒體來源促凋亡的caspases激活劑 低等電點的直接結(jié)合IAP蛋白 Smac Diablo caspase的協(xié)同激活劑 凋亡誘導因子 apoptosisinducingfactor AIF 激活核酸酶裂解DNA成小片段 凋亡蛋白抑制劑 inhibitorofapoptosisproteins IAP caspase的直接抑制劑 內(nèi)核酸酶 G endonucleaseG 等 細胞色素c Cyt c Cyt c是線粒體呼吸鏈的重要組成之一 細胞損傷后 線粒體膜通透性增高是釋放Cyt c 并與細胞凋亡激活因子1 apoptoticproteaseactivatingfactor1 Apaf 1 線蟲ced 4的同源物 結(jié)合 并活化caspase 9前體 進而激活caspase 3 引發(fā)caspases級聯(lián)反應 從而誘發(fā)細胞凋亡 在脊椎動物細胞凋亡過程中 線粒體被認為是處于凋亡調(diào)控的中心位置 凋亡體 apoptosome 凋亡體也稱為死亡復合體 deathcomplexes 是細胞線粒體對凋亡性死亡作出反應的關鍵步驟 它是由線粒體通透性增高而釋放的某些線粒體蛋白如Cyt c Smac Diablo等啟動的 由Cyt c和Apaf 1形成七聚體的凋亡體 heptamericapoptosome 再通過它的caspase募集功能域 caspaserecruitmentdomain CARD 募集并激活caspase 9前體 激活caspase 3 caspase 6 caspase 7 使凋亡達到了頂峰 五 凋亡與壞死主要鑒別 形態(tài)學 六 凋亡與增生 萎縮 在靜止細胞和終末期細胞中誘導細胞凋亡是困難的 因為細胞內(nèi)不出現(xiàn)凋亡分子 細胞凋亡分子不會在所有的細胞類型和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的條件下出現(xiàn) 2 細胞因子 Cytokines 的作用 細胞因子是由多種細胞合成和釋放的 是有生物活性的蛋白和多肽之統(tǒng)稱 主要有5類 1 生長因子 growthfactors 2 克隆刺激因子 colonystimulatingfactors 3 白介素 interleukin 4 腫瘤壞死因子 tumornecrosisfctorsTNF 5 干擾素 interferon 細胞因子通過信號傳導與細胞因子受體結(jié)合而產(chǎn)生效應 一旦細胞因子釋放減少 或信號傳導 或受體障礙就會引起效應細胞的凋亡發(fā)生 如前列腺 腎上腺皮質(zhì)在嗜該器官激素減少后 由于手術或藥物的方法 以及哺乳后的乳腺的生理萎縮與退化中 結(jié)扎主導管后腮腺的萎縮 部分由上皮細胞凋亡而介導 當然萎縮還累及到細胞間質(zhì)的喪失和殘留活細胞體積的縮小 這些改變雖然與凋亡相互協(xié)調(diào) 卻與凋亡截然不同 在部分生理性萎縮與退化中有凋亡機制參與 凋亡在正常周期性刺激的上皮 包括人體子宮內(nèi)膜表皮等細胞更新中與核分裂相平衡 在某些情況下凋亡明顯表現(xiàn)為某些細胞 選擇性 如睪丸經(jīng)放射或暴露于放射性藥物后 精原細胞選擇性死亡 而間質(zhì)細胞卻保留著 使性功能 性特征保留 但生育能力降低 七 凋亡與炎癥炎癥的基本病變中 滲出是最重要的 沒有滲出就不稱為炎癥 炎癥時從血管滲出的中性白細胞 在病灶中完成抗炎功能后 不能重回血管 需要啟動細胞凋亡的機制 使炎癥終止 創(chuàng)口修復中的肉芽組織 成纖維細胞增生與膠原分泌 以及隨后纖維母細胞轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維細胞 及疤痕形成 凋亡機制也可能參與愈合 研究自身免疫性疾病 病毒感染中自身反應性T B淋巴細胞 對某些病毒感染細胞 細胞毒性靶細胞和一些腫瘤細胞 通過凋亡的方式 來清除與消退 淋巴細胞發(fā)育成熟過程中 約有95 的細胞發(fā)生凋亡 TC抗原受體 TCR 基因發(fā)生重排時 TCR基因某一連接點上發(fā)生等位基因無意義突變 細胞即走向凋亡 即使產(chǎn)生正確TCR分子的細胞還必須經(jīng)過進一步的嚴格選擇機制 使可能導致自身免疫性疾病的細胞凋亡 這就是胸腺的陰性選擇機制 B淋巴細胞的發(fā)育過程與TC相似 編碼免疫球蛋白的基因片斷要經(jīng)過基因重排 才能在細胞表面產(chǎn)生獨特的個體型免疫球蛋白的受體 如果發(fā)生錯誤重組 表面免疫球蛋白 SIG 就不能正常表達 引起克隆消除 從而把可能引起自身反應性的BC清除掉 這就是BC的陰性選擇機制 成熟的WBC的壽命以天計算 死一批 生一批 互相交替 嚴格有序 若細胞凋亡障礙 只生不死 就會發(fā)生WBC堆積 WBC增生癥 對自身抗原反應的細胞該死的不死 還會發(fā)生自身免疫性疾病 八 凋亡與腫瘤腫瘤形成除癌基因激活外 還伴有一個或多個抑癌基因功能的喪失 而且凋亡理論的研究無疑對腫瘤研究產(chǎn)生了重大的影響 并使人們對腫瘤發(fā)生機制的認識有了一個觀念上的更新 原來腫瘤形成不僅是瘤細胞的過度增生 還存在死亡過少 凋亡機制障礙 細胞凋亡參與癌癥起始過程 并對癌癥發(fā)生負調(diào)控作用 一 凋亡對腫瘤的影響1 細胞增生 凋亡 2 細胞增生 凋亡變化不顯著3 細胞增生 凋亡 增生 凋亡 增加凋亡能干預腫瘤的發(fā)生與發(fā)展 許多腫瘤凋亡指數(shù) ApoptoticindexAI 與腫瘤進展 預后有關 如 基底細胞癌 baselcellcarcinoma 就癌細胞來說其異型性和分化程度應為高度惡性的腫瘤 但其生物學行為為低度惡性表現(xiàn) 僅為局部浸潤很少轉(zhuǎn)移 研究發(fā)現(xiàn)該腫瘤中細胞凋亡明顯 這對降低腫瘤浸潤與轉(zhuǎn)移有一定關系 乳腺癌 作為激素控制的靶器官 乳腺細胞凋亡受激素控制 細胞凋亡調(diào)控異常是乳癌發(fā)生的原因之一 ER PR 的乳腺癌抗雌激素治療 或卵巢切除去勢療法能使瘤細胞發(fā)生凋亡 BCl 2陽性乳癌 產(chǎn)生耐藥主要是抑制化療藥物阿霉素誘發(fā)細胞凋亡的作用 前列腺癌是男性常見腫瘤 隨著前列腺特異性抗原 prostaticspecificantigen 的應用 新發(fā)現(xiàn)的前列腺癌急劇增多 雄激素依賴型前列腺癌 AndrogendrpendentprostaticcarcinomaADPC BCl 2 時 性腺切除 雄激素拮抗劑的治療有效 其機制是對雄激素敏感的癌細胞在缺乏雄激素后凋亡 雄激素非依賴型前列腺癌 AndrogenIndependentprostaticcarcinomaAIPC BCl 2 時 治療效果差 轉(zhuǎn)移性前列腺癌70 病人只有短暫療效 3年內(nèi)復發(fā)轉(zhuǎn)變?yōu)锳IPC 新研究發(fā)現(xiàn)抗寄生蟲藥 蘇拉明 suramin 可誘導AIPC中癌細胞凋亡 膀胱癌也是一種常見腫瘤 復發(fā)率高 10 25 浸潤 預后差 研究結(jié)果顯示 從正常移行上皮演變?yōu)?級 級的膀胱癌時BCl 2表達明顯低于 級膀胱癌 提示BCl 2可能在腫瘤進展和轉(zhuǎn)移中起一定作用 小細胞肺癌BCl 2 BCl XL表達為主 而非小細胞肺癌以BCl XL為主 BCl I基因家族表達的失衡對肺癌細胞凋亡有重要作用 總之增加癌細胞的凋亡能干擾腫瘤的生物學過程 二 腫瘤細胞凋亡與基因調(diào)控根據(jù)調(diào)控基因功能分為兩大類 這兩類基因相互作決定細胞的生死命運 細胞增殖抑制基因 p35 p53 RB DOC 與粘附分子類似基因 WT 11 促進細胞凋亡的基因 wimlstumortype 1 DAD1 等 自殺基因 suicidalgene 凋亡蛋白 凋亡基因 細胞凋亡促進基因 APO 1 Fas TGF SP2 Bax c rel Bel XS Bak 2抑制細胞凋亡的基因 促進細胞增殖的基因 c myc c eld1 ras v src 生長基因 抗凋亡基因 抑制細胞凋亡的基因 Bcl 2 EIB LMW 5 HL C Kit Bel XL 三 凋亡相關基因有三類 1 細胞凋亡過程表達的基因 多數(shù)抑癌基因 2 促細胞凋亡基因 多數(shù)抑癌基因 3 抑制細胞凋亡基因 多數(shù)癌基因 凋亡與細胞增殖有許多潛在的聯(lián)系 從細胞形態(tài)學上看 細胞凋亡與有絲分裂的超微結(jié)構事件 如核膜消失 染色體凝集 細胞膜內(nèi)陷等有許多共同之處 從分子水平上看 有許多原癌基因和抑癌基因與細胞增殖和凋亡有關 它們通過各自的通道參與細胞凋亡的調(diào)控 研究較多的基因有BCL2 Caspase家族 IAP家族 Fas P53 C myc等 1 Bcl 2家族Bcl 2家族包含一組相關蛋白 它們分別與Bcl 2在4個保守區(qū)具有同源結(jié)構域 BH1 4 并以此作為結(jié)構基礎 形成同源性或異源性二聚體 通過蛋白 蛋白之間的相互作用 調(diào)節(jié)細胞的凋亡 在細胞凋亡途徑的上游遠端 構成一個重要的細胞內(nèi)凋亡調(diào)控點 1 Bcl 2家族的組成 細胞內(nèi)Bax高表達時 細胞對死亡信號敏感 加速細胞凋亡 當Bcl 2高表達 Bcl 2可與Bax形成異源性二聚體 抑制細胞凋亡 所以Bcl 2 Bax的比例對決定細胞凋亡的敏感性起重要作用 抑制凋亡因子 促進凋亡因子的總比率 最終決定細胞的的生存或死亡 4 Bcl 2在腫瘤中的表達與腫瘤的發(fā)生 Bcl 2在多種腫瘤中的表達已得到證實 一般來說 Bcl 2陽性的腫瘤要比Bcl 2陰性的腫瘤預后差 在一些比較常見的惡性腫瘤中 Bcl 2表達經(jīng)常陽性的有 慢性淋巴細胞白血病 慢性髓白血病伴有原始細胞危象者和急性髓白血病幾乎l00 陽性 濾泡淋巴瘤80 陽性 T B非霍奇金淋巴瘤65 陽性 霍奇金淋巴瘤40 陽性 乳腺癌80 陽性 神經(jīng)母細胞瘤40 陽性 鼻咽癌80 陽性 前列腺癌75 陽性 肺鱗癌25 陽性 肺腺癌10 15 陽性 在85 的濾泡型惡性淋巴瘤 存在t 14 18 q32 q21 這一染色體易位使位于14號染色體長臂的免疫球蛋白重鏈基因和位于18號染色體的bcl 2基因的轉(zhuǎn)錄活性位點拼接 造成bcl 2基因的過度表達 使B淋巴細胞免予凋亡而長期存活 并可能附加其他基因的突變而發(fā)展成淋巴瘤 Bcl 2的免疫染色最常用于區(qū)別反應性濾泡性淋巴瘤 在甲狀腺中 Bcl 2抗體還不能用于區(qū)別橋本甲狀腺炎和低分化MALT淋巴瘤 Bcl 2 Follicularlymphoma Bcl 2immunostaining Follicularlymphoma Bcl 2 反應性增生淋巴結(jié) Bcl 2免疫染色 在生發(fā)中心Bcl 2陽性 如何判斷 同時做CD3免疫染色證實為生發(fā)中心T細胞浸潤 2 Caspase家族Caspase家族是一組蛋白酶 介導即將死亡的細胞高效而特異的蛋白水解作用 是細胞凋亡的執(zhí)行者 Caspase蛋白水解酶有2個特征 都是半胱氨酸蛋白酶 作用部位都在天冬氨酸殘基后的位點 Caspase家族功能凋亡其它caspase 4 TX ICH 2 ICEref 炎癥caspase 5 TY ICEref 炎癥caspase 13 ERICE mcaspase 11 ICH 3 mcaspase 12炎癥caspase 1 ICE 炎癥caspase 14 MICE caspase 3 CPP32 apopain Yama 效應者酶caspase 7 Mch3 ICE LAP3 CMH 1 效應者酶caspase 6 Mch2 效應者酶caspase 8 MACH FLICE Mch5 啟動者酶caspase 10 Mch4 啟動者酶caspase 2 ICH 1 mNedd2 啟動者酶caspase 9 ICE LAP6 Mch6 啟動者酶CED3 Caspase家族的組成至今已發(fā)現(xiàn)有14種Caspase 分為3組 1 Caspase 2 8 9 是細胞凋亡的起始Caspase 2 Caspase 3 6 7 執(zhí)行細胞凋亡 是效應Caspase 這兩組Caspase在細胞凋亡中缺一不可 3 由Caspase 1 4 5組成 與細胞凋亡的關系不是很密切 可能與多種炎癥因子的成熟有關 2 Caspase的活化途徑Caspase家族的蛋白都是以非活性的酶原方式存在于胞質(zhì)中 當它們通過一定的途徑被活化后 依據(jù)一定的順序 裂解一些重要的蛋白底物 導致相應底物的活化或滅活 最后可能需通過信號轉(zhuǎn)導途徑 產(chǎn)生凋亡細胞的一系列的形態(tài)和生物化學的改變 3 IAP家族IAP家族是抑制細胞凋亡作用的一組蛋白 在人類已確認有6種IAP相關蛋白 NAIP c IAP1 hIAP 2 c IAP2 hIAP 1 XIAP hICP Survivin和BRUCE 有研究表明 以上蛋白的過表達 都可以不同程度地抑制多種因素如TNFR Fas受體介導的 柔紅霉素 VP 16誘導的以及去除生長因子后所引起細胞凋亡 有研究表明在酵母和哺乳動物細胞中 IAP家族蛋白抑制caspase的活性 抑制細胞凋亡 作用強度為XIAP c IAP2 c IAPl Survivin 5種IAP在人體內(nèi)的不同組織中分布不同 XIAP分布較廣 除外周血的白細胞以外 成人或胚胎的其他組織中均有表達 c lAPl c IAP2在腎 小腸 肝 肺和神經(jīng)系統(tǒng) 低級 表達較高 NAIP在成人肝 胎盤中有所表達 腦中亦有微量表達 RT PCR方法可檢測到 Survivin在正常細胞中 除了正在分裂的細胞之外 它在成熟的終末分化組織中基本無表達 而在胚胎發(fā)育過程中和人的部分腫瘤組織中表達 是一個新的腫瘤標記 有報道說 Survivin與腫瘤細胞的抗藥性 腫瘤轉(zhuǎn)移過程中的血管生成以及某些腫瘤如神經(jīng)母細胞瘤等的預后不良有關 4 Fas 也稱為APO 1 CD95 是1989年兩家實驗室同時發(fā)現(xiàn)在細胞株表面介導凋亡的蛋白分子 屬于NTFR 腫瘤壞死因子受體 和NGFR N生長因子受體 家族 分子量45000 細胞膜抗原 能抑制腫瘤細胞增殖 誘導凋亡 許多耐藥與復發(fā)的腫瘤中CD95和Fasl突變 尤其在淋巴瘤 白血病和腸癌病人中常有FasAPO 1的表達 對預后有一定影響 Fasl為T淋巴細胞上Fas的天然配基 ligant Fasl與表達Fas的細胞結(jié)合 即導致后者走向凋亡 5 P53 對P53的認識分三個階段 在80年代初一經(jīng)發(fā)現(xiàn)就認為是一種腫瘤基因 后來發(fā)現(xiàn)主要表現(xiàn)在癌中所以稱為癌基因 經(jīng)過相當一段時間后 隨著對凋亡研究的深入 89年才證明P53為抑癌基因 腫瘤基因 癌基因 抑癌基因 正常細胞內(nèi)存在野生型P53對細胞增殖有抑制作用 研究發(fā)現(xiàn)細胞在轉(zhuǎn)化過程中表達P53有三種情況 無變化 細胞停滯在G1期 細胞凋亡 6 c myc 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子c myc在多種腫瘤中高表達 對增殖和凋亡均有調(diào)控作用 它能夠促進細胞增殖 誘導細胞凋亡和抑制細胞分化 即使在有的腫瘤細胞 如HL 60白血病細胞 不能直接促進凋亡 它也能增加細胞對各種凋亡誘導因素的敏感性 當某些抑癌因素存在時 抗癌因子 低濃度血清 抑止細胞周期因子 c myc蛋白促進細胞凋亡 當有致癌因素存在時c myc蛋白促進癌細胞增殖 7 其他與細胞凋亡有關的基因 死亡基因ced3 ced4 ICE interleukin lp convertingenzyme 是哺乳動物細胞的凋亡蛋白酶 與線蟲凋亡基因ced3同源 在細胞凋亡中起 劊子手 作用 可以誘導多種類型的凋亡 但是ICE介導的細胞凋亡受BCL2所抑制 吞噬基因參與凋亡細胞吞噬 并非導致細胞死亡 如ced1 ced2 ced6 ced7 ced8 核酶基因Nmc 1 四 凋亡與腫瘤治療的研究鑒于凋亡是腫瘤細胞死亡的一種形式 又有如此眾多的癌基因和抑癌基因參與凋亡的調(diào)控 因而人為地施加影響以激發(fā)凋亡誘導基因的活性和降低凋亡抑制基因的活性 可能是治療腫瘤的有效途徑 事實上 目前臨床上所采用的各種抗腫瘤的治療方法如化療 放療 物理治療 生物治療 促細胞分化治療甚或基因治療多是通過誘導細胞凋亡 以求達到治療腫瘤的目的 腫瘤的療效判定應考慮到 是否經(jīng)過治療后發(fā)生凋亡 這是腫瘤化療效果好壞的關鍵之一 增加凋亡指數(shù) ApoptosisIndex 與增生指數(shù) proliferatoryIndex 的比值AI PI 已成為新的治療目標 同時能否誘導細胞凋亡已成為篩選抗癌藥物的新標準 誘導細胞凋亡的治療將是對腫瘤治療方法的重要補充與革新 目前治療腫瘤的新設想 在腫瘤治療中誘導凋亡 1 導入P53 野生型WT 抑制腫瘤增生 2 下調(diào)突變型P53 BCl 2的活性與表達 減弱其對細胞凋亡的抑制 3 抑癌基因引入瘤細胞 降低致瘤性 使腫瘤細胞逆轉(zhuǎn)為正常細胞 4 引入某些細胞因子 抑制腫瘤惡性表型 使細胞喪失致瘤性 5 應用點突變技術 使異常表達癌基因失活或修復突變基因 6 導入藥物敏感基因 有助于細胞凋亡 九 凋亡與其他疾病1 細胞凋亡異常增加 不該死的死了 神經(jīng)系統(tǒng)退行性變 a 老年性癡呆 b色素性視網(wǎng)膜炎 c 帕金氏綜合征 骨髓發(fā)育不良綜合征 惡性貧血 缺血性損傷 心肌梗死 缺血缺氧性腦病 腎小球腎炎 肝病變 病毒性肝炎和酒精性肝炎 AIDS 2 細胞凋亡過度減少 該死的不死 自身免疫性疾病 a 系統(tǒng)性紅斑狼瘡 SLE b 腎小球腎炎 GN 等 腫瘤 a 激素依賴性腫瘤 乳腺癌 前列腺癌 卵巢癌 b 造血系統(tǒng)腫瘤 淋巴瘤 白血病 等 各種病毒感染 腺病毒 皰疹病毒 痘病毒等 十 凋亡的檢測方法1972年keer提出細胞凋亡的概念 1980年用電泳檢測細胞凋亡 并證實了DNA斷裂的特征 1986年在秀麗降桿線蟲 caeovhabditiselegan 中觀察1090個體細胞 其中131個細胞在發(fā)育過程中通過凋亡而消失 并找到兩個基因ced3 ced4 他們的表達與細胞凋亡密切相關 故稱為死亡基因 因此細胞凋亡的檢測經(jīng)歷以下幾個過程 從單純形態(tài)學辯認 形態(tài)與生化結(jié)合 形態(tài) 生化 分子生物學技術相結(jié)合的多種手段 一 凋亡檢測要解決的問題是 1 被研究體系中是否有凋亡發(fā)生 即定性 2 凋亡的發(fā)生率 顯示群體細胞的量度 這是一個相對的概念 應同時結(jié)合細胞群體的增殖率來分析 則更客觀 更能反應細胞群體的生長狀態(tài) 3 了解細胞凋亡的嚴重度 以反應凋亡的階段 二 檢測細胞凋亡各種形態(tài)學方法比較檢查方法可鑒定凋亡細胞的特征光學顯微鏡 LM 細胞縮小 核濃縮 細胞周圍透明圈相差顯微鏡 PCLM 細胞鼓泡 凋亡小體透射電鏡 TEM 微絨毛消失 核染色質(zhì)沿核膜分布新月體形成 凋亡小體激光共聚焦 CLSM 凋亡細胞固縮染色質(zhì)及核碎片定位掃描電鏡 SEM 細胞表面泡狀突起流式細胞儀 FCM 低前向散射光 高側(cè)向散射光縮時攝影術 TLP 凋亡細胞的形成過程 2 流式細胞儀檢測細胞凋亡時膜通透性增加介于正常細胞與壞死細胞之間 用熒光素染色細胞懸液 利用流式細胞儀測量細胞懸液中的細胞熒光強度來區(qū)分正常細胞 凋亡細胞 壞死細胞 常用Hoechs PI染色 正常細胞對染料拒染 熒光著色淡 凋亡細胞主要攝取Hoechs染料呈強藍色熒光 壞死細胞DNA有強的嗜PI性呈強的紅色熒光 3 核酸電泳檢測細胞凋亡 DNA片斷檢測細胞凋亡 細胞凋亡和壞死時 細胞中DNA發(fā)生斷裂 小分子DNA片斷增加 高分子DNA減少 胞漿內(nèi)出現(xiàn)DNA片斷 然而凋亡細胞的DNA斷裂是由內(nèi)源性的內(nèi)切酶作用 斷點都是規(guī)律性的發(fā)生在核小體之間 因此出現(xiàn)180 200bp及其倍數(shù)的DNA片斷 壞死細胞的DNA片斷是無特征的雜亂片斷 在凝膠電泳中出現(xiàn)的特征性的泳帶可以判斷凋亡細胞 這方法缺乏定位特性 無法確定哪個細胞發(fā)生凋亡 4 酶聯(lián)免疫吸附法 ELISA法 ELISA方法檢測細胞凋亡后形成的由組蛋白及DNA片斷組成的核小體 此方法敏感性高 所需細胞數(shù)少 可檢測低至5 102 mL的凋亡細胞 此外 此方法不需特殊儀器 比較適合基層工作 缺點 1 不能精確測定凋亡發(fā)生的絕對量 2 適合單一成分細胞的檢測 對于多細胞成分的組織或細胞混合物 不能判定凋亡發(fā)生在哪種細胞 3 不能提供單個細胞或相關細胞的組織學定位 5 DNA片斷原位標記1993年Wifsman等提出DNA片斷末端標記法 Fehsel等1994年提出原位缺口轉(zhuǎn)移檢測細胞凋亡的方法 這些方法的提出把凋亡研究帶進了新階段 特別是這些技術發(fā)展為原位凋亡檢測試劑盒 早期凋亡的檢出TUNEL 缺點 1 壞死細胞亦有DNA裂點形成 也可呈現(xiàn)TUNEL反應陽性 因而特異性較差 2 TUNEL結(jié)合免疫組化檢測時 固定過程對檢測的影響較大 切片的大小 薄厚會直接影響到固定效果 從而產(chǎn)生結(jié)果的差異 Tunel反應 探針 靶核酸DNA DNA為間接法 雜交體 探針 半抗原標記物 標記探針 靶核酸 雜交體 酶標特異性抗體 顯色 間接法原位雜交示意圖 DAB鏡下控制 顯色 水洗75 酒精85 酒精95 酒精無水酒精 Tunel檢測法 灌注固定大鼠肝 Tunel反應陽性 DAB顯色 血管內(nèi)無紅細胞背景染色 125 非灌注固定大鼠肝 Tunel反應陽性 肝細胞核BCIP NBT顯色呈紫黑色 血管內(nèi)紅細胞呈桃紅色 250 RNA酶 RNase 保護實驗這種高度敏感的實驗技術來源于對某些噬菌體的DNA依賴性RNA聚合酶的研究 這種酶是從DNA模板上合成高度特異性RNA探針的理想工具 用來檢測和定量研究mRNA 這樣 cDNA片斷可以被克隆到含有噬菌體引物的質(zhì)粒中 并可用來合成放射性標記的反義RNA探針 應用人類凋亡模板試劑盒中32P標記的反義RNA探針與從標本中分離的RNA雜交 再行RNA酶處理 最后用放射自顯影或吸光度分析法分析翻譯產(chǎn)物 此實驗的優(yōu)點是敏感性高 可在一份總的RNA標本中同時定性不同種類的mRNA 用RT PCR方法進行mRNA的半定量分析提取細胞的RNA 與逆轉(zhuǎn)錄酶 RNA酶抑制劑 RNAsin 和dNTP孵育合成cDNA 然后在特異性cDNA引物誘導下進行PCR反應 最后瓊脂糖凝膠電泳測定PCR反應產(chǎn)物的大小 實驗的靈敏性很高 但是對于細胞組成不單純的組織或細胞懸液說來 不能確定與凋亡相關基因的mRNA來源于哪類細胞 所以還應當進行蛋白表達的研究 截止目前為止 凋亡檢測的方法已有許多種 但任何一種方法都有自身的缺點和應用的局限性 影響檢測結(jié)果的判斷和意義分析 如果需要解決這些問題 在檢測中已測出有凋亡發(fā)生時 如何解釋結(jié)果 如何與疾病和腫瘤的發(fā)生發(fā)展聯(lián)系起來呢 首先我們必須建立正常時該體系的凋亡狀態(tài) 正常對照組 以判斷檢測組凋亡是生理性 還是病理性 同時檢測該體系細胞增殖狀態(tài) 對照該體系的增殖指數(shù)和凋亡指數(shù) 以判斷該體系細胞周轉(zhuǎn)率 建立致病因素對被測體系影響的對照組 確定該致病因素與被測體系細胞增殖 凋亡的相關性 對照組的控制 如何定量與排除其它干擾 十一 凋亡的生物學意義細胞凋亡是生物體內(nèi)無用的 老化的 或一些損傷的細胞死亡的一種形式 不引起局部組織損傷或炎癥反應 主要意義在于生物進化的需要 競爭性的選擇機制 是保證個體發(fā)育 成熟 和維持正常生理過程所必需 1 清除多余的細胞2 清除無用的細胞3 清除有害的細胞4 清除衰老的細胞5 有選擇性地清除細胞 十二 存在的問題與展望雖然發(fā)現(xiàn)細胞凋亡的現(xiàn)象已經(jīng)近40年 但人們真正認識到其重大的理論和實際意義 還是近幾年的事 細胞凋亡分子機制的研究說明細胞的凋亡過程是受基因調(diào)控 是主動連續(xù)的程序化反應 在細胞凋亡研究中還有許多關鍵問題末解決 1 在細胞發(fā)育過程中 細胞凋亡究竟是何時 又是如何開始的 時間與方式 機體是如何決定一個細胞將要走向死亡的 在細胞有絲分裂和成熟之間有沒有能激活細胞凋亡的開關點基因 Switchpointgene 存在 2 機體內(nèi)有沒有真正的殺手基因 Killergene 存在 死亡相關基因是如何調(diào)控的 3 細胞凋亡究竟是通過哪些信號傳導途徑起作用 4 哪些疾病與細胞凋亡規(guī)律失常有關 能否通過調(diào)控細胞凋亡來達到治療目的 5 細胞凋亡與衰老的關系如何 是否有活命基因 survivalgene 的存在 如果能發(fā)現(xiàn)凋亡特異性的基因或其產(chǎn)物 或其他特異性的標志物 就可能成為檢測凋亡的指標 目前對凋亡的認識是一個連續(xù)的過程 進一步研究也許會發(fā)現(xiàn)凋亡存在不同的階段 而不同階段可能會出現(xiàn)不同的標志物 從而發(fā)現(xiàn)凋亡階段性標記物 凋亡機制在細胞生長 發(fā)育過程中所具有的獨特的生物學效應 可以通過增加或降低某些特定的細胞對凋亡的敏感性來發(fā)展治療疾病的新方法和藥物 阻斷凋亡可能有利于艾滋病的治療 某些N激素的基因替代療法可能對中樞N系統(tǒng)的退行性病變有益 應該承認對細胞凋亡的研究還剛剛開始 如何利用分子生物學和細胞生物學等當代最新技術 從分子水平上深入揭示細胞凋亡的啟動 發(fā)生和發(fā)展規(guī)律 為研究胚胎發(fā)生 發(fā)展 個體形成 器官的細胞平衡穩(wěn)定 自身免疫性疾病 腫瘤形成的原因等增加新的理論內(nèi)容 并以此來指導醫(yī)療實踐 還有很多工作要做 謝謝 同學們 來學校和回家的路上要注意安全 同學們 來學校和回家的路上要注意安全